一、目的与意义骨关节炎(O A)也称退行性关节病,本病是由于关节软骨完整性破坏以及关节软骨下骨板病变,导致关节症状和体征的一组异质性疾病。按照关节分布可以分为局限性和全身性骨关节炎。膝骨关节炎(简称KOA)作为局限性骨关节炎的代表,临床上以关节疼痛、僵硬、活动受限、活动时可有磨擦响声为特征。本病中年以后多发,发病率随年龄增长而增高,严重危害着中老年人的健康。OA的病因目前尚不明了,一般认为KOA发病主要是由生物力学因素,遗传因素,外源性因素的参与导致滑膜,软骨和骨的代谢改变,进而产生炎症,结构破坏。其最基本的病理改变是关节软骨的损伤退变。现代医学认为,软骨降解是软骨退变的一个重要方面,大量研究证实,OA软骨降解与细胞因子表达异常有关。在正常情况下,关节软骨基质的分解代谢和合成代谢平衡是通过分解性细胞因子和合成性细胞因子(即生长因子)的平衡来维持的。分解性细胞因子如白细胞介素-1(IL-1),主要是刺激生成特殊的基质金属蛋白酶(MMP),引起基质的降解,并可通过刺激滑膜细胞增殖和变性,诱导炎性介质形成,促进滑膜细胞金属蛋白酶分泌,抑制或干扰软骨细胞及表型表达等。生长因子主要包括转化生长因子(TGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)。生长因子具有促进细胞生长、增殖,通过自分泌或旁分泌方式对骨和软骨的形成和修复起局部调节作用。其中,转化生长因子(TGF-β)是一个重要的因子,许多研究表明TGF-β在维持关节软骨正常和关节修复中有重要的意义[’]：一方面通过调节基质成分含量维持基质的正常更新,另一方面通过调节关节软骨细胞的形成、增殖与分化来保持正常数量和正常生理状态的软骨细胞。在正常表达情况下TGF-p对软骨是一种保护性因子,但在病理条件下,TGF-p表达的异常升高也会对软骨造成损坏,并诱发骨赘形成。目前针对骨关节炎治疗在于缓解疼痛、阻止和延缓疾病的进展、保护关节功能、改善生活质量。治疗原则以非药物治疗联合药物治疗为主,必要时手术治疗。非药物治疗包括患者的教育、运动和生活指导以及物理治疗。药物治疗分两大类：1)控制症状的药物：包括解热镇痛类,非甾体类抗炎药,阿片类药物,激素等；2)改善病情的药物(DMARAs)及软骨保护剂：此类药物一般起效慢,需治疗数周见效,具有降低基质金属蛋白酶、胶原酶等活性,既可抗炎、止痛、又可保护关节软骨,有延缓骨关节炎发展的作用。如双醋瑞英,它是IL-1抑制剂,可抑制软骨降解、促进软骨合成并抑制滑膜炎症。它不仅能有效地改善骨关节炎的症状,减轻疼痛,改善关节功能,还可以延缓骨关节炎病程的进展。祖国医学认为膝骨关节炎属痹证、骨痹范畴,多以肝脾肾亏虚为本,气滞血瘀痰凝、风寒湿邪侵袭,痹阻经络为标,属本虚标实之证[21]。肝脾肾亏虚,筋骨失养是发病之本：中医学认为,膝为肝脾肾三经所系,筋骨肉之大会。肝藏血主筋,肾藏精主骨,脾主运化合肉。而OA的发生多为中老年人,肝肾渐亏,筋骨懈惰；筋失血养,无以柔韧；骨失髓养,无以强壮；肉失脾主,虚赢无力。所以KOA的发病与肝脾肾三脏虚弱关系最为密切。气滞、血瘀、痰凝是膝骨关节炎发病的重要环节：气为血帅,血为气母；气滞可致血瘀,血瘀加重气滞。由于膝关节是人体负重最大和关节面积最大的关节,亦是人体参与运动最重要的关节,最易受到损伤。膝关节损伤,脉络受损,阻塞经络,致气滞血阻,经络受阻。或由于肝脾肾亏虚,气血运行不畅、痰凝经络,膝关节及周围组织失养,从而引起关节软骨的退变,导致KOA的发生与发展。风寒湿外邪侵袭、痹阻经络,久而关节变形,活动受限,形成骨痹,其是KOA发病的重要因素。中医治疗本病主要在于解除疼痛症状,改善关节功能,保护关节结构。结合中医的整体观念,辨证论治,中药、针灸、推拿等多种手段综合运用,从膝关节局部用药和全身整体出发,充分发挥中医药的优势综合治疗,从而使患者的症状有效改善。风湿康冲剂是临床治疗骨关节炎应用二十多年的经验方,全方组成：淫羊藿、地黄、秦艽、杜仲、丹参、牛膝、延胡索等,具有补益肝肾,强筋健骨,活血止痛之功效。全方重用淫羊藿,杜仲,以滋补肝肾,强筋骨。本方临床疗效确切,为了进一步推广使用,有必要对该复方深入研究。本实验旨在探索风湿康冲剂对实验性大鼠膝骨关节炎软骨组织形态学变化,以及IL-1β,TGF-β1,MMP-13表达的影响,探讨其治疗KOA的作用机制。二、方法与内容2.1研究对象健康Wistar大鼠48只,雌雄各半,体重180-220g,实验前先适应性饲养一周,4%木瓜蛋白酶膝关节腔注射建立大鼠KOA模型,1周后48只大鼠平均分成6组：正常组、模型组、双醋瑞英组,风湿康低剂量组1.35g／kg／d,风湿康中剂量组2.7g／kg／d,风湿康高剂量组5.4g／kg／d,正常组与模型组给与等体积的生理盐水,共4周。2.2一般情况除外正常组,观察各组大鼠造模前后精神状态、毛发光泽度、饮食、活动、关节等。2.3血清中IL-1β和TGF-β1检测采用腹主动脉采血2ml,3000r／min离心15mmin取上层血清,行ELISA法检测各组大鼠血清中IL-1p和TGF-β1的含量。2.4病理组织检查：处死动物后,切取大鼠右膝关节,去除外面的皮肤,肌肉组织,放入10%的甲醛溶液中固定,再行脱钙,石蜡包埋、切片、作HE染色,进行光镜观察。2.5膝关节软骨中MMP-13的检测切片常规脱蜡入水,过氧化氢封闭,枸橼酸盐缓冲液(PH6.0)微波法修复抗原,加1：200兔抗鼠MMP-13单克隆抗体,4℃孵育过夜,PBS洗,加EnVision二抗,室温孵育30min,PBS洗,DAB显色,蒸馏水冲洗,苏木素复染,二甲苯透明,封片。阴性对照用PBS代替一抗。在显微镜下观察,拍片,通过图像数码采集系统及Image pro plus6测量其含量。2.6统计分析应用SPSS13.0软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差表示,血清中IL-1p和TGF-β1的含量,软骨中MMP-13的表达均采用单因素方差分析,多重比较采用Bonferroni法,以a=0.05为显著性水准。三、结果3.1一般情况正常组活泼,毛发光泽,能正常活动,饮食,无关节肿胀；模型组神态萎靡少动,毛发欠光泽,脱毛较明显,食少,局部肿胀,有明显舔舐及跛行现象。药物治疗组大鼠上述表现均有不同程度的改善。3.2ELISA结果模型组较正常组IL-1p的含量显著升高(P<0.001)。风湿康冲剂低中高3个剂量组均能降低IL-1β的水平,且随着剂量的增高,IL-1p的下降越显著,双醋瑞英组与风湿康冲剂高剂量组比较P>0.05,差异无统计学意义。模型组较正常组血清中TGF-β1的含量显著升高(P<0.05)。与模型组比较,除外风湿康冲剂低剂量组,风湿康冲剂中剂量,高剂量和双醋瑞英组均能显著升高TGF-p1的水平(P<0.001)。3.3关节病理正常组软骨基质染成粉红色,着色均匀,软骨表面光滑,软骨细胞排列整齐,四层结构清晰可辨,潮线完整。模型组关节软骨破坏最为严重,软骨表面粗糙不整,出现明显裂隙深达移行层,软骨细胞排列紊乱,四层结构分辨不清晰。风湿康低剂量组与模型组基本相似。风湿康中剂量组软骨表面欠光滑,软骨细胞变性,基质变性。双醋瑞英组四层结构基本清晰,潮线基本完整,少许关节软骨细胞有轻度变性。风湿康高剂量组关节软骨内有少许炎细胞浸润,关节软骨细胞有轻度变性,潮线基本完整。3.4免疫组化结果正常对照组未见MMP-13的表达；模型组中全层软骨细胞质中可见MMP-13的表达,为深棕褐色颗粒；风湿康冲剂低剂量组也几乎全层表达；风湿康冲剂中剂量组在关节软骨表层和移行层表达,为浅棕褐色颗粒,风湿康冲剂高剂量组和双醋瑞英组只在关节软骨表层可见少许棕褐色颗粒。与模型组比较,风湿康冲剂中剂量和高剂量组均可显著抑制MMP-13在膝关节软骨中的表达(P<0.001),风湿康冲剂高剂量组与双醋瑞英组在抑制MMP-13在膝关节软骨中的表达方面,P>0.05,差异无统计学意义。四、结论风湿康可能是通过降低血清中IL-1α的水平,升高血清中TGF-β1的水平,减少MMP-13在关节软骨中的表达,从而对骨关节炎发挥治疗作用。其中风湿康冲剂高剂量组较低中剂量组在抗炎和软骨保护方面有显著的优势。