芍药种子休眠与萌发相关基因PlPP2C的克隆及遗传转化

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芍药(Paeonia lactiflora Pall.)为芍药科芍药属的草本花卉,既是我国的传统名花,同样又是十分具有特色的园林造景植物。芍药种子具有典型的上、下胚轴双重休眠的特性,这种休眠特性使其在种子繁殖过程中,经常会因为不能打破休眠而导致萌发率低,种子繁殖的生长周期过长,为实际生产带来很大障碍,尤其是对新品种选育和杂交育种工作造成很大困难。本研究以芍药品种(♂粉玉楼×♀粉玉奴)的杂交种子为试材,选取种子萌发过程中四个关键时期进行转录组测序,通过分析转录组数据,筛选得到调控芍药种子休眠与萌发的基因PlPP2C,克隆获得了该基因的cDNA全长序列,并对其进行了生物信息学分析及其在种子萌发过程中的表达模式分析、构建了植物表达载体、通过花序浸染法对拟南芥进行遗传转化,为揭示该基因在芍药种子萌发的过程中所起的作用奠定基础。主要研究结果如下:1.通过分析转录组数据,找出脱落酸信号转导途径中调控种子休眠与萌发的相关基因PlPP2C。以转录组测序得到的CDS序列为依据设计引物,通过PCR技术克隆得到芍药种子PlPP2C基因。PlPP2C基因ORF序列全长1233bp,编码410个氨基酸,氨基酸序列含有PP2Cs基因特征序列FFGVYDGHG及保守结构域,属于PP2Cs基因家族。氨基酸序列同源性比对发现,PlPP2C基因与川桑(Morus notabilis)、葡萄(Vitis vinifera)、巨桉(Eucalypyptus grandis)、榴莲(Durio zibethinus)等植物的同源性较高。系统发育树显示,PlPP2C基因与拟南芥AHG1亲缘关系最近。PlPP2C基因编码的蛋白分子量为45kDa,理论等电点5.04,是一个疏水性不稳定蛋白,不具有跨膜结构,定位于细胞核上。2.通过实时荧光定量的方法,分析了PlPP2C基因在芍药种子发育过程中四个关键时期的表达情况,结果显示,PlPP2C基因在下胚轴萌发(露白)阶段表达量最高,而在种子吸胀前的表达量最低,推测该基因可能通过调控种子中ABA的含量而促进其萌发。3.构建了PlPP2C基因的植物表达载体,命名为pBI121-PP2C,并通过冻融法将构建成功的植物表达载体转化到农杆菌GV3101中。种植了野生型拟南芥并收获种子,采用农杆菌介导的花序浸染法对野生型拟南芥植株进行了遗传转化,并收获T0代种子,通过抗生素筛选获得了抗性植株。
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