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酶是一种天然催化剂,具有反应条件温和、选择性高、原子经济性高等绿色化学的典型特征,在手性精细化学品的合成中具有巨大应用潜力。然而,天然酶往往难以适应工业催化中的高温、高渗透压、高剪切力等条件。因此对天然酶进行热稳定性改造是生物催化和酶工程研究的热点。醇脱氢酶KpADH可用于手性双芳基醇的合成,但其热稳定性较差,不利于大规模应用。本文以KpADH为研究对象,通过分子改造提高其热稳定性,并从结构方面解析其热稳定性的分子机理。主要研究内容和结果如下:(1)影响KpADH热稳定性关键位点的选取。首先采用易错PCR构建了KpADH的全序列随机突变文库,从8000个突变体中筛选获得了6株热稳定性提高的突变体(N159D、T248S、K210E、S167A、Q272L和K36E),突变体的T5015值相较于野生酶提升了1.5~1.9°C,且除突变体S167A和K36E外,突变体保持了与野生酶相当的比活力。建立了基于侧链扰动和自由能分析的组合策略(Rapid Enzyme Stabilization via Pertuabation and Energy Analysis,RESPEA),通过分子动力学模拟确定了KpADH的9个结构柔性区域,通过残基作用网络和中心度分析鉴定了柔性区域中的79个易扰动位点,虚拟突变预测上述位点的自由能变化,最终选定24个突变体进行实验验证。结果显示,K36E/I、T132D、N159D、K210D/E、T248A和Q272F/L/M等10个突变体的稳定性有所增强,尤其是T248A和T132D,其T5015值由野生型的42°C提升至45.8°C和44.7°C。(2)KpADH热稳定突变体的组合及进化分析。对上述关键位点进行定点饱和突变以获得各位点的氨基酸突变规律,基于最佳单突变体进行迭代组合,获得最优突变体KpADHTh6(K36I/T132D/N159D/K210E/T248A/Q272L)。KpADHTh6的T5015值为53.1°C,比野生酶高11.1°C,45°C的半衰期为3000 min,是野生型的2700倍。动力学参数分析表明,突变体Kp ADHTh6对底物CPMK的kcat/KM是野生型的1.3倍。进一步,对热稳定性突变酶进行去卷积分析,构建了热稳定性适应路径景观图(fitness pathway landscape),结果显示迭代过程中未出现显著的协同效应,T132D和N159D之间存在拮抗作用。(3)KpADHTh6热稳定性机制的解析及不对称还原反应体系的构建。通过座滴法得到了KpADHTh6-NADP+的复合物蛋白质晶体,通过X-ray衍射获得了突变酶晶体结构。通过模拟分析,发现KpADHTh6稳定性的提升主要由于突变改变了局部氨基酸侧链的扰动、引入新的盐桥、增强了局部疏水堆积作用。突变体T132D和N159D之间的拮抗作用是由于H134的侧链朝向所引起。将Kp ADHTh6与实验室前期构建的KpADHMu-S5组合获得KpADHTh6-S5,在30°C条件下12 h可以完全反应1 M底物CPMK,显著高于野生酶。本论文通过分子改造显著提高了醇脱氢酶KpADH的热稳定性,对醇脱氢酶的分子改造和应用醇脱氢酶合成手性化合物具有重要指导意义。