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目的： 理想的人造心脏瓣膜应当具有天然瓣膜的生物学结构，无免疫源性，具有自我更新和生长能力，耐久性好能终生使用。组织工程心脏瓣膜(tissue engineering heart valve，TEHV)具有自体活细胞，能够自我更新和改建，生物力学和血流动力学性能优良，耐久性好，无需抗凝，符合理想人造心脏瓣膜的条件。几年来经过众多研究者的努力，TEHV研制取得了令人瞩目的进展，但过度到临床应用尚需在种子细胞、支架材料、构建方式及相关设备等方面进一步完善。目前构建TEHV的种子细胞主要是来源于自体血管壁的成纤维细胞及内皮细胞，但从自体血管壁获取种子细胞不但技术复杂，培养周期较长，而且会给机体造成一定创伤，常规临床应用并不现实；支架材料主要有生物可降解合成聚合物支架和天然瓣膜支架。鉴于现有合成支架材料的性能还达不到构建瓣膜组织的要求，而同种心脏瓣膜的来源缺乏，TEHV支架材料的研究仍以去细胞猪主动脉瓣为主。虽然动物实验证实去细胞异种瓣膜支架的免疫反应及炎性反应微弱，但临床试验已有去细胞猪瓣(SynerGraft瓣)发生早期衰坏及功能障碍的报道，表明现有的去细胞方法并不理想，必须改进。本研究尝试采用血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)诱导原代培养的骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)分化为血管内皮细胞的可行性，以寻找更为便捷可行的种子细胞来源。应用低浓度胰酶+表面活性剂脱氧胆酸(deoxycholic acid，DCA)+核酸酶的方法制作去细胞猪主动脉瓣支架，以探索去细胞效果确切而又能有效保留天然瓣膜生物力学性能的去细胞方法。通过BMSCs分化细胞的种植实验，进一步考察BMSCs在去细胞支架上生长的生物学行为，评价用BMSCs构建TEHV的可行性。 方法： 1．绵羊BMSCs的体外培养及诱导分化研究 髂嵴穿刺抽取绵羊骨髓液，Percoll密度梯度离心法获取BMSCs，DMEM培养液体外培养扩增，采用α-SMA、vimentin免疫组化染色及α-SMA表达的流式细胞仪(FCM)分析鉴定细胞表型。免疫组化Ⅰ、Ⅲ型胶原染色评价BMSCs分泌胶原的功能。以含表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)，碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、胰岛素样生长因子(insulin like growth factor，IGF)和肝素的M199培养液培养原代细胞，并以VEGF诱导BMSCs向内皮细胞分化。通过CD34、CD31流式细胞仪分析，免疫组化CD34、Ⅷ因子相关抗原染色鉴定内皮细胞，荆豆凝集素第二军医大学博士学位论文中文摘要胸心外科专业(u lex eur叩aeus agglutinin，UEA)结合实验及一氧化氮(No)含量测定评价内皮细胞功能。 2.去细胞猪主动脉瓣膜支架的制备 在猪宰杀后20分钟内清洁条件下取出心脏，4℃冰盐水冲洗。切取主动脉瓣叶或带瓣主动脉管道。瓣叶采用75%酒精消毒2分钟，主动脉带瓣管道修剪后30KGrayY射线照射消毒。分别采用0.01%胰蛋白酶十核酸酶+l%Triton持续震荡24小时(组1)，0.01%胰酶8小时+核酸酶+l%DCA持续震荡24小时(组2)及1%DCA+核酸酶持续震荡32小时(组3)三种方法对新鲜猪主动脉瓣叶及带瓣主动脉管道进行去细胞处理。新鲜瓣叶作为对照(组4)。去细胞效果的评价:通过常规石腊包埋切片HE染色，扫描电镜及透射电镜观察评价去细胞瓣叶的组织学结构和去细胞效果。去细胞瓣叶的生物力学性能评价:应用单轴拉伸实验绘制应力一应变曲线、应力松驰曲线，测定各组瓣叶在应力为O.3MPa时的弹性模量，加载一卸载曲线下的面积比，同一应力下的伸长比及松驰率。通过拉断实验测量各组瓣叶的最大抗张强度及断裂伸长比。运用Studeni一t检验比较各组去细胞瓣叶的生物力学指标。去细胞支架的免疫源性及炎性反应评价:将去细胞瓣叶及主动脉管道裁剪后植入SD大鼠背部皮下，并分别于包埋2周和4周后取出瓣叶，4周和8周后取出主动脉壁及瓣下肌肉组织，切片HE染色及免疫组化vimentin、Q一SMA染色评价去细胞支架的免疫源性、体内炎性反应及改建情况。 3.组织工程心脏瓣膜的体外构建 采用静态、立体及分次种植的方法将BMSCs分化的肌成纤维样细胞及内皮细胞分别种植于去细胞瓣叶及整体主动脉瓣支架上构建TEHVs。分别于DMEM和M199全培养液中培养7~8天后取出，通过石腊包埋切片HE染色，扫描及透射电镜观察评价TEHVs的组织学结构，考察BMSCs及其分化细胞在去细胞天然瓣膜支架上生长的生物学行为。免疫组化Q一SMA、CD34及Vm因子相关抗原染色鉴定种植细胞的表型。 全里: 1.原代培养的BMSCs贴壁后呈三角形、多角形和梭形，3一5天后呈集落样生长。传代细胞为均一梭形，呈指数增殖，5ml骨髓液分离得到的BMSCs在体外培养扩增2周即可获取107一108个细胞。其自然分化细胞a一sMA、vimentin及I、111型胶原染色阳性，a一SMA表达水平(平均荧光强度)与血管壁肌成纤维细胞无明显差异，超微结构示胞浆内含有丰富的粗面内质网及分泌小泡，提示具有旺盛的分泌功能;BMSCs经内皮细胞条件培养及VEGF体外诱导2周后分化为内皮细胞，呈三角形及多角形，表达第二军医大学博士学位论文中文摘要胸心外