玉米组蛋白去乙酰化酶ZmHDA101调控籽粒大小的分子机制研究

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组蛋白乙酰化是组蛋白翻译后水平的一种可逆的动态修饰过程,其稳定状态的维持是由多种组蛋白乙酰基转移酶(HATs)和去乙酰化酶(HDAcs)共同作用的结果。这种可逆的乙酰化修饰影响染色质结构、调控基因的转录,最终参与植物生长发育的调控。本文围绕玉米组蛋白去乙酰化酶ZmHDA101影响籽粒发育的调控机理开展研究,取得的主要研究结果包括:1.制备了能特异识别玉米内源ZmHDA101蛋白的抗体。以授粉后不同天数的玉米籽粒进行免疫印迹实验,表明ZmHDA101在玉米籽粒中稳定表达。2.对玉米超表达ZmHDA101转基因株系进行分子鉴定,发现由于转录后共抑制导致ZmHDA101基因:在授粉后4天和8天的转基因株系中沉默表达,我们将超表达株系命名为突变体进行研究。3.表型鉴定和切片观察证实,hda101突变体的胚乳传递细胞与野生型相比发育异常。进一步RNA-seq和RT qPCR结果表明,hda101突变体的传递细胞特异基因在4天籽粒中下调表达,并且ZmHDA101对维持这些基因在种子发育早期的表达模式至关重要。4. ZmHDA101 ChIP-seq实验表明,ZmHDA101在基因区有明显分布,而在基因间区富集较少且获得了7578个直接调控的目标基因。结合ChIP-seq分析和基因表达证实,ZmHDA101在高表达和中等表达水平的靶基因的转录起始位点(TSS)和基因体区(gene body)都有明显富集。5.以组蛋白乙酰化抗体进行免疫印迹实验表明,授粉后4天和8天的hda101突变体籽粒的组蛋白乙酰化和野生型相比显著增加。进一步比较hda101突变体和野生型的ZmHDA101靶基因上组蛋白乙酰化发现,约33%的ZmHDA101靶基因的组蛋白乙酰化(H4K5ac)在hda101突变体显著增加;进一步分析证实,当ZmHDA101的缺失发生在其靶基因的TSS和TTS,H4K5ac增加发生在TSS区,而基因体区缺少ZmHDA101蛋白会导致靶基因的整个基因区H4K5ac增加。6.分析ZmHDA101靶基因的组蛋白乙酰化和表达变化发现,127个ZmHDA101靶基因的H4K5ac和转录水平在hda101突变体中显著增加。分析这部分基因的组织表达特异性证实,这些基因在种子发育过程中呈低表达或转录沉默状态。进一步分析这些基因的低表达和ZmHDA101富集关系表明,在种子发育早期ZmHDA101结合在这部分基因上维持这些基因的低表达或转录沉默状态。7.通过免疫共沉淀实验鉴定17个ZmHDA101的互作蛋白,其中包括转录抑制复合体组分ZmSNL1和ZmNFC103。酵母双杂实验也证明ZmHDA101能与ZmSNL1、ZmNFC103互作。进一步实验发现ZmSNL1的HID结构域能和ZmHDA101的HDAC结构域互作,而ZmNFC103的a螺旋和WD40结构域可以和ZmHDA101的HDAC域的N端结合。8.综合以上研究结果,我们发现玉米组蛋白去乙酰化酶ZmHDA101通过两种不同的调控机制调控下游基因,第一、ZmHDA101结合在转录活跃基因的TSS和gene body进行去乙酰化,但并不导致转录水平的变化。第二、ZmHDA101可以结合在一小部分转录不活跃的基因上维持这些基因在种子发育过程中的转录抑制状态。ZmHDA101介导这两种不同的调控机制影响了胚乳传递细胞基因的表达最终调控种子发育。
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