随着免疫学研究的不断深入和基因工程技术的迅速发展，为避免传统灭活苗接种剂量较大，产生免疫力较慢，弱毒苗毒力返强的缺点，针对不同疾病已开展了各种新型基因工程疫苗的研制。但这些疫苗普遍存在分子小、免疫原性弱、难以诱导机体产生有效免疫应答等不足，从而需要某种载体或佐剂来弥补这种不足。传统载体或佐剂又存在许多缺陷，如引起局部炎症反应、致癌、不易在体内降解等，所以需要研发新型载体或佐剂来克服上述缺点[183]。壳聚糖，是来自甲壳素的天然高分子多糖，在体内其能被溶菌酶生物降解。具有黏膜粘附的特点，是一种黏膜吸收增强剂，己被用作黏膜给药的载体。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)由乳酸和羟基乙酸随机聚合而成，是一种可降解的功能高分子有机化合物[186]，具有良好的生物相容性、成囊、成膜和无毒性。在美国PLGA已通过FDA认证，被正式作为药用辅料收录进美国药典[187]。甘露糖是目前唯一用于在临床上的糖质营养素，其可直接被利用合成糖蛋白，参与免疫细胞上甘露糖受体介导的内吞等免疫调节作用，进一步激活T淋巴细胞，提高MHC-I和MHC-II分子的抗原递呈。因此运用壳聚糖、PLGA和甘露糖这三种可生物降解材料作为新型的疫苗载体或佐剂具有巨大的潜力。本研究采用分子生物学技术，从铜绿假单胞菌标准株ATCC27853和铜绿假单胞菌水貂分离株DL9基因组中获得外膜蛋白OprF190-342和OprI21-83的基因，并通过融合PCR的方法将其融合在一起。利用DNAStar、DNAMAN和多个生物学网站对其进行生物信息学分析。OprF190-342-OprI21-83基因的核苷酸序列在铜绿假单胞菌不同菌株间高度保守；蛋白成亲水性，二级结构主要以α螺旋为主。随后综合多种有利于直接表达具有活性重组蛋白的条件，在大肠杆菌表达系统中成功可溶性表达铜绿假单胞菌标准株ATCC27853的外膜蛋白OprF190-342-OprI21-83（FI），利用凝血酶去除其载体上的GST标签，实现无标签蛋白FI的可溶性表达。巨噬细胞和树突细胞等免疫细胞表面都具有丰富甘露糖受体（MMR）的表达，用甘露糖修饰载体，则能通过受体介导的吞噬作用，来提高细胞对于药物的摄取。因此，本研究以甘露糖和壳聚糖为材料，在氰基硼氢化钠的催化下，使甘露糖的羧基与壳聚糖的氨基发生缩合反应，将甘露糖修饰到壳聚糖上，获得甘露糖修饰的壳聚糖衍生物。以已获得的铜绿假单胞菌外膜融合蛋白FI为模式抗原，采用离子凝聚法和复乳法成功制备了含有抗原FI的壳聚糖微球载体疫苗（FI-CS-MPs）、甘露糖修饰的壳聚糖微球载体疫苗（FI-MCS-MPs）、壳聚糖包衣的PLGA微球载体疫苗（FI-CP-MPs）和甘露糖修饰的壳聚糖包衣的PLGA微球载体疫苗（FI-MCP-MPs）。并通过扫描电镜、粒径测定仪、BCA蛋白浓度测定等方法对这四种生物可降解多糖微球载体疫苗的表征进行了检测。结果显示四种微球疫苗均成正球体，形态规则，分散性良好，表面不光滑成粗糙状态，无褶皱；平均粒径大小都在2~3μm；包封率与载药量良好；在体外抗原释放实验中，可降解多糖微球载体疫苗在最初的12小时内释放出约30%~50%的抗原FI，并且经过甘露糖修饰的微球载体疫苗的释放率始终高于未经甘露糖修饰的微球载体疫苗。以获得的四种可降解多糖微球载体疫苗为基础，将模式抗原FI标记上FITC荧光，通过流式细胞术和激光共聚焦两种免疫学技术，比较小鼠巨噬细胞RAW264.7对这四种可降解多糖微球载体疫苗的摄取情况。结果显示，小鼠巨噬细胞RAW264.7对含有FITC-FI的微球载体疫苗的摄取率比游离的FITC-FI显著增高；且对甘露糖修饰的微球载体疫苗摄取率最高，显著高于对照组。通过免疫荧光和免疫组化的方法，体内外均成功验证经过甘露糖修饰的微球载体疫苗可以靶向小鼠巨噬细胞RAW264.7和小鼠NALT组织上的巨噬细胞甘露糖受体。本研究利用小鼠巨噬细胞RAW264.7和NF-κB和MAPK信号通路试剂盒，通过Western-blot方法，揭示生物可降解多糖微球载体疫苗可以显著激活小鼠巨噬细胞RAW264.7NF-κB和MAPK信号通路。并且经过甘露聚糖抑制甘露糖受体，甘露糖修饰的壳聚糖微球载体疫苗激活这两条信号通路的现象明显消失。用获得的生物可降解多糖微球载体疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠，间接ELISA和流式细胞术检测免疫后各个时间点小鼠黏膜和系统体液特异性抗体水平和T淋巴细胞亚型情况。结果显示，在体液水平方面，最先检测到的抗体为肺脏研磨液中的FI特异性IgM，随着免疫时间的延续其抗体效价逐渐减少；在鼻腔灌洗液和支气管灌洗液中，甘露糖修饰的壳聚糖微球组特异性IgA抗体效价在免疫初期显著高于对照组；并且在滴鼻免疫的远端黏膜部位小肠灌洗液中，与对照组相比甘露糖修饰的壳聚糖微球组特异性IgA抗体水平也显著增高；在激活黏膜部位抗体水平的同时，在血清中的特异性IgA和IgG水平也显著增高，甘露糖修饰的壳聚糖微球组显著高于对照组。肺脏、小肠派尔氏结和脾脏中，甘露糖修饰的壳聚糖微球组的T淋巴细胞亚型CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+均显著升高，并伴随细胞培养上清液中IL-4和IFN-γ的显著表达，提示甘露糖修饰的微球疫苗呈现混合Th1/Th2反应。生物可降解多糖微球载体疫苗可以显著提高最小致死量铜绿假单胞菌攻毒小鼠的存活率。在BALB/c小鼠体内，生物降解多糖微球载体疫苗具有良好的滴鼻免疫效果，随后本研究通过间接ELISA和HE染色组织学观察等方法，研究其在本体动物水貂中滴鼻黏膜免疫后，抗体水平的变化情况，评价其免疫效果。结果显示，甘露糖修饰的微球疫苗组在免疫初期的血清IgG抗体水平显著高于对照组，且持续到免疫观察末期。壳聚糖微球载体疫苗可以显著提高铜绿假单胞菌攻毒水貂的存活率，FI-CS-MPs、FI-CP-MPs、FI-MCS-MPs和FI-MCP-MPs组水貂的存活率分别是62.5%、62.5%、75%和62.5%，但由于实验过程中的攻毒过程为急性感染，所以甘露糖修饰的壳聚糖微球疫苗组存活率与未经甘露糖修饰的壳聚糖微球疫苗组存活率无显著差异。组织学观察，壳聚糖微球载体疫苗可以显著减轻铜绿假单胞菌攻毒水貂肺脏和脾脏的炎症反应。总之，本研究成功制备含有铜绿假单胞菌外膜融合蛋白FI的经过甘露糖修饰的壳聚糖可生物降解微球载体疫苗（FI-MCS-MPs和FI-MCS-MPs）。体内外验证其可以靶向巨噬细胞甘露糖受体。经过BALB/c小鼠和本体动物水貂滴鼻免疫以后，显示与对照组相比其可以较早的显著增强黏膜和系统体液及细胞免疫应答，呈现混合Th1/Th2反应。对铜绿假单胞菌攻击的小鼠和水貂具有很好的保护率。因此，甘露糖修饰的壳聚糖可生物降解微球载体是一个很有潜力的可生物降解滴鼻黏膜免疫疫苗载体。为生物可降解多糖微球载体疫苗在水貂等经济毛皮动物中的应用提供可靠的理论和实验依据。