宫内生长迟缓(IUGR)是指宫内不良环境引起胎儿出生体重低于相应孕周胎儿平均体重第10百分位数或平均体重两个标准差。宫内不良环境可以影响胎儿发育，引起IUGR。而且，大量的流行病学和实验室研究已经发现那些存活的IUGR患儿与成年期发生的疾病如2型糖尿病、心血管疾病等密切相关并可以遗传至下一代，这类疾病目前被称为是“胎儿起源的成人疾病”。表观遗传学(epigenetics)是研究不涉及DNA序列改变的基因表达和调控的可遗传修饰。属于表观调控机制之一的微小RNA(miRNA)作为RNA干扰的主要执行者，与RNA诱导沉默复合体结合，然后和靶mRNA3UTRs序列特异性互补，调节基因表达，导致翻译抑制或使mRNA失去稳定性。　　近期已经研究发现，IUGR致成年期发生慢性缺氧性肺动脉高压（CH-PAH）敏感性增高。但目前大部份表观遗传学证据的靶点是内皮途径调控肺动脉高压，研究PASMCs上Kv通道的相关表观调控机制证据较少。现有研究表明，和心血管肌细胞重构密切相关的是miRNA-1家族。miRNA-1家族包括miRNA-1，miRNA-206和miRNA-133a/b。目前miRNA-1家族能否直接调控Kv通道表达及其相关机制尚不清楚。　　基于上述机理，本课题以宫内生长迟缓新生鼠为模型，成年期给予2周常压缺氧，继而筛选PASMCs上发生病理性改变的相关Kv通道，研究其在IUGR相关肺动脉高压中可能存在的作用，并通过高通量芯片筛选参与调节的相关miRNA，探讨miRNA在Kv通道调节IUGR相关的肺动脉高压中的作用，深入阐明RNA干扰参与此生物学反应的过程及其机制。　　第一部分 Kv1.5介导IUGR诱导大鼠成年期低氧性肺动脉高压的研究　　目的:　　1.观察IUGR大鼠缺氧后肺血管病理学改变，监测肺循环血流动力学改变。　　2.观察IUGR诱导的缺氧性肺动脉高压大鼠模型中相关Kv通道表达和功能的改变。　　3.建立大鼠原代PASMCs，观察缺氧的不同时间点，平滑肌细胞的增殖情况以及相关Kv通道亚型的表达和功能变化，评估Kv通道和细胞增殖的关系。　　方法:　　1.动物模型的建立和分组:　　IUGR及其缺氧组:全孕期给予母鼠正常饮食50％的量，直至产下IUGR仔鼠，仔鼠生长至12周给予2周低氧。　　Control及其缺氧组:全孕期给予母鼠自由饮食直至产下正常仔鼠，仔鼠生长至12周给予2周低氧。　　2.模型的评估:测量缺氧2周后右心室收缩压，并用α-SMA免疫组化染色观察肺血管的肌化程度，western blot检测α-SMA在肺动脉中的表达丰度，测量右心室与左心室加室间隔的比值[ratio of right ventricle to left ventricle plus septum，RV/(LV+S)]评价右心室肥厚情况。　　3.应用钾通道阻断剂4-氨基吡啶(4-AP)，四乙胺(TEA)和BaCl2比较阻力肺动脉对各种离子通道阻断剂的收缩性。　　4.用酶消化法分离大鼠的PASMCs，采用膜片钳测定4-AP作用前后全细胞电流、膜电阻。　　5.Western blot法检测Kv通道蛋白在肺动脉平滑肌组织的表达情况。　　6.建立PASMCs原代培养，鉴定并行MTT试验。免疫荧光染色法检测Kv通道相关亚型在PASMCs表达情况。　　7.过表达Kv通道相关亚型，观察PASMCs增殖改变。　　结果:　　1.Control组大鼠右心室平均收缩压(RVSP)22.88±0.38 mmHg，IUGR组RVSP为23.76±0.28 mmHg，两组之间无明显统计学差异。缺氧处理后，两组RVSP明显增加，而且IUGR-hypoxia组较Control-hypoxia组显著升高，肺动脉平滑肌层显著增厚，α-SMA表达显著增加，右心指数显著增大。　　2.微血管张力测定发现，4-AP引起明显的血管收缩，BaCl2引起微弱的血管收缩，TEA基本不引起血管收缩。缺氧后，4-AP引起的收缩明显减弱，且IUGR-hypoxia组弱于Control-hypoxia组，差异有统计学意义。　　3.缺氧后，IUGR-hypoxia组肺微小动脉平滑肌层Kv1.5表达低于Control-hypoxia组，Kv1.2、Kv2.1、Kv3.1及Kv9.3蛋白水平无明显差异，PASMC单细胞Kv电流显著低于Control-hypoxia组，各组膜电阻无明显差异。　　4.细胞形状及α-SMA免疫荧光鉴定，95％以上为平滑肌细胞。　　5.KCNA5质粒转染PASMCs后过表达Kv1.5，MTT试验检测细胞增殖水平，IUGR-hypoxia组各时间点OD值与Control-hypoxia组无明显差异，Kv1.5表达及全细胞Kv电流无明显差异。转染前，IUGR-hypoxia组48小时OD值显著高于Control-hypoxia组。　　结论:　　1.证实IUGR大鼠成年期遭遇低氧发生更严重的肺动脉高压，阻力肺动脉病理性重构加重。　　2.IUGR大鼠成年期发生严重的缺氧性肺动脉高压与PASMCs Kv1.5通道蛋白的表达和功能改变密切相关。　　3.Kv1.5通道蛋白的表达升高可以抑制缺氧引起IUGR大鼠原代肺动脉平滑肌细胞增殖的效应。　　第二部分 miRNA-206调控IUGR大鼠肺动脉平滑肌细胞对低氧反应性的研究　　目的:　　1.从整体动物水平筛选并验证IUGR大鼠成年期发生缺氧性肺动脉高压的关键miRNA亚型。　　2.在细胞水平观察miRNA-206的改变引起的Kv1.5蛋白表达变化以及细胞增殖能力的变化，评价miRNA-206和上述指标之间的关系。　　方法:　　1.miRNA3.0芯片检测肺动脉平滑肌组织miRNA表达情况，结合数据库预测，筛选与IUGR大鼠成年期发生低氧性肺微小动脉重构的miRNA亚型。　　2.扩大样本，实时荧光定量PCR结合探针技术验证缺氧前后miRNA亚型筛选结果。　　3.在第一部分建立的原代PASMCs基础上，用CoCl2建立细胞缺氧模型，用miRNA mimic干预细胞。　　4.western blot法检测Kv1.5蛋白表达情况，EdU试验检测细胞增殖状态。　　结果:　　1.miRNA3.0芯片检测结果显示，IUGR组和Control组相比，肺动脉平滑肌组织中miRNA-184和miRNA-206增长倍数高于≥2.0，且q值≤0.05。　　2.TargetScan数据库预测软件分析KCNA5是miRNA-206的靶基因之一。　　3.western blot检测发现，应用miRNA-206 mimic后，control-hypoxia组PASMCs Kv1.5蛋白表达量下降至IUGR-hypoxia组水平，两组相比无明显差异。　　4.EdU试验发现，应用miRNA-206 mimic后，control-hypoxia组细胞增殖较转染前加快，control-hypoxia组与IUGR-hypoxia组相比无明显差异。　　结论:　　1.miRNA-206是参与调节IUGR大鼠成年期发生低氧性肺肺动脉高压的关键分子之一。　　2.miRNA-206通过调节缺氧对Kv1.5蛋白表达的抑制作用，影响PASMCs细胞增殖状态。