设施辣椒是我国特种优势农产品,占膳食消费比重也越来越大。国内关于其真菌毒素污染的相关基础研究很少,给食品安全及相关产业带来严重隐患。伏马毒素是镰刀菌次级代谢产生的一种真菌毒素。伏马毒素可降低农作物的生产性能、损伤动物和人的免疫系统、干扰鞘脂代谢,对人和动物健康构成严重威胁。以往研究表明:伏马毒素对设施辣椒的污染在国外比较普遍。为了明确我国设施辣椒中伏马毒素的污染状况和发生规律,本实验在全国范围内采集了34个城市的设施辣椒样本,通过对其进行菌种分离鉴定,确定了我国设施辣椒的主要致病镰刀菌种类,进而研究不同致病镰刀菌产伏马毒素的规律,最后对茄腐镰刀菌产伏马毒素的分子机制进行探究。1、从全国34个城市地区采集了腐烂和健康的设施辣椒样本900份,采用组织分离的方法对青椒样本的发病部位和健康部位的镰刀菌进行分离和纯化,共分离到277株镰刀菌。运用形态学和分子生物学的方法对分离到的镰刀菌进行鉴定。形态学鉴定主要通过观察菌落形态、生长速度、颜色、大小等,并结合菌丝的形态和分身孢子的有无及其特点等特征进行种属的鉴定。分子鉴定采用真菌的通用型引物Internal Transscribed(ITS)和镰刀菌的特异性引物Elongation factor 1-α(EF-1α)对菌株的序列扩增,PCR产物经测序后在NCBI核酸数据库进行BLAST分析。形态学和分子生物学鉴定获得污染我国设施辣椒的镰刀菌45株,分属8个种。得出我国的设施辣椒上的主要致病镰刀菌有木贼镰刀菌(F.equiseti)、多育镰刀菌(F.proliferatum)、藤仓镰刀菌(F.fujikuroi)、串珠镰刀菌(F.verticillioides)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、茄腐镰刀菌(F.solani),其中木贼镰刀菌为优势菌株。实验结果表明中国设施辣椒上的优势菌株与国外的不同,因此在辣椒上伏马毒素的防控和辣椒烂果病的预防要与国外的方法有所不同。2、探索时间对不同致病镰刀菌产伏马毒素的影响及镰刀菌在不同生物培养基中的产毒规律。选取从我国设施辣椒上分离到的频次较高的木贼镰刀菌、多育镰刀菌、藤仓镰刀菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌、茄腐镰刀菌进行实验,将这些代表菌株分别接种到大米培养基中,25℃黑暗培养,分别选取培养7d、14d、21d、28d、35d检测其伏马毒素产量。检测结果表明:串珠镰刀菌、藤仓镰刀菌和多育镰刀菌在0-28d时,伏马毒素总产量逐渐升高,28d时达到最大,在28d-35d时,毒素总含量随时间的增加而有所减少;尖孢镰刀菌和茄腐镰刀菌在21d时伏马毒素总量达到最高,在21d后随着时间的增加毒素含量逐渐下降。将不同镰刀菌分别接种到大米培养基和设施辣椒上,25℃黑暗培养14d,检测不同培养基伏马毒素含量。实验结果显示:菌株在大米培养基上的产毒水平高于设施辣椒;相同镰刀菌在不同的培养基上和不同时间产伏马毒素水平存在显著差异;不同菌株在相同的培养基上产毒水平也不相同。此外,研究还发现无论在大米培养基上还是设施辣椒上,茄腐镰刀菌均能产生伏马毒素,这一研究还未被报道。3、对茄腐镰刀菌产伏马毒素的分子机制进行探究。一方面,采用特异性引物FUM1、FUM8、FUM19对茄腐镰刀菌进行PCR扩增,选取高产伏马毒素的串珠镰刀菌作为正对照,及不产伏马毒素的木贼镰刀菌做负对照。另一方面,对该茄腐镰刀菌进行基因组高通量测序,并对测序结果进行分析。实验结果如下:由于茄腐镰刀菌电泳无特异性条带出现,表明该镰刀菌中并不含有FUM1、FUM8、FUM19序列,通过对基因组高通量重测序结果分析,得出该菌株体内无FUM基因存在,但通过基因比对,发现伏马毒素合成相关的辅助基因,如GBP1、CPP1等。