蜂王浆（以下简称王浆）是哺育蜂咽下腺、下颚腺分泌的以蛋白为主的乳状液体。它不仅为蜂王及三日龄以内小幼虫提供营养及能量来源，还是一种对人类健康有益的功能性保健品。尽管王浆中的大多蛋白成分已被鉴定，但王浆中所含未知蛋白仍值得深入研究。蛋白质的翻译后修饰可赋予其更多生物功能活性，确定蛋白质修饰的类型及定位修饰的位点是研究蛋白质功能的关键步骤，但对王浆蛋白的翻译后修饰至今未见深入报道。为更好理解王浆生化性质及其生物学功能，深刻认识其对蜜蜂生物学及人类健康的生物学意义，研究王浆中蛋白质的翻译后修饰及发现未知蛋白具有重要意义。本研究利用基于凝胶的双向电泳、胶内酶切，以及非凝胶液内酶切，TiO2磷酸化肽段富集，酰肼/凝集素N-糖基化蛋白/肽段富集，结合高通量高灵敏度高分辨率的液质联用和生物信息学等技术手段，分析王浆蛋白质的四种翻译后修饰（磷酸化、甲基化、脱酰胺、糖基化）位点及修饰类型特点，并对王浆中未知蛋白成分进行了鉴定。在王浆中共发现4种磷酸化蛋白。王浆主蛋白1、2的磷酸化修饰，使其具备更有效的促进营养物质吸收和合理利用的钙磷比例。蜂毒蛋白2前体的磷酸化修饰通过丝氨酸磷酸化的去磷酸化，可以快速有效地保护蜂王和小幼虫免受病虫害侵袭。而磷酸化的类脂蛋白-III与泛素作用相协调能增强蜂王与小幼虫的免疫调节能力。甲基化修饰是引起王浆蛋白等电点漂移和保持高粘度的主要原因，以保障小幼虫在开口向下或开口水平的巢房中正常生长发育而不至于从中滑落。王浆蛋白较高的脱酰胺发生率是王浆蛋白对温度敏感的重要内在本质，这从分子水平上解释了王浆需要在低温存放的原因。哺育蜂为适应王浆对温度敏感的特点，其进化的生物学策略是短时频繁地喂食蜂王和小幼虫王浆，以保证饲喂最新鲜的王浆促进其蜂王产卵和幼虫快速生长发育。采用互补的N-糖富集方法和不同生物质谱仪对王浆N-糖蛋白组的研究发现，王浆蛋白质中的27个蛋白在57个位点发生N-糖修饰，其中有46个位点为首次在王浆蛋白中得到鉴定的N-糖位点，此外还有9个预测的N-糖位点在本实验中得到证实。这也证明本研究所采用的方法可以全面有效地鉴定王浆蛋白中N-糖基化的修饰信息。王浆主蛋白家族的7个成员都是N-糖蛋白。王浆主蛋白家族中发生如此高的N-糖修饰，可能是为增强王浆主蛋白的溶解度，以便更有效的为蜜蜂和人类利用。王浆N-糖蛋白中大多仅含一个糖基化修饰位点，但多位点修饰的N-糖蛋白多鉴定为与代谢功能相关的蛋白，这表明王浆为适应蜂王和小幼虫对能量代谢的大量需求，其蛋白质通过加强糖基化修饰来提高蛋白/酶的活性以满足对能量代谢的需求。王浆中具抗菌、抗氧化、及机体免疫等活性的蛋白许多都发生了N-糖基化修饰，这表明N-糖修饰可能是赋予王浆蛋白这些生物学功能的内在本质。在王浆糖蛋白中，N-糖肽保守序列N-X-T含量更高，约占所有糖肽段的2/3，而N-X-S保守序列仅占1/3。这进一步揭示了王浆N-糖蛋白的分子生化特征。与此同时，本研究还在王浆中鉴定出16个先前未在王浆中发现的蛋白，这些蛋白多属于代谢相关和保健功能相关类蛋白。扩展了我们对王浆蛋白组成的认识。本研究系统地从全新角度分析了王浆蛋白质翻译后修饰的修饰特点，并在王浆中发现了未知蛋白，这不仅对深刻认识王浆的生化本质，也对深刻理解其为蜜蜂生物学和人类健康所做的贡献具有重要意义。