研究背景类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis, RA)是一种以关节滑膜炎症为中心病理的自身免疫病,其突出病理特点是滑膜增生并侵蚀关节软骨和骨质,最终导致关节破坏畸形。RA滑膜成纤维细胞(rheumatoid arthritis synovial fibroblasts, RASFs)大量增生并伴随大量炎症细胞浸润和新生血管形成是滑膜增生的基础。RA的关节破坏主要发生在血管翳增生浸润的软骨部位,滑膜组织血管翳可分为具免疫作用和侵蚀作用的两部分。前者由位于滑膜组织衬里下层的T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞组成,介导抗原提呈、产生抗体和细胞因子,与滑膜炎症和过度增生有关；后者主要指紧邻骨和软骨损伤周围的滑膜组织和细胞,由过度增生的滑膜成纤维细胞和血管翳共同组成。在RA的病理进展中,RASFs发生活化并能产生大量炎症因子、基质蛋白和组织水解酶,造成局部炎症和关节软骨破坏,继而导致整个关节的损伤。RASFs增生的机制主要有二类,一是受多种致炎因子所驱动的炎症性增生(被动性增生),这其中肿瘤坏死因子-α (TNF-α)起到主要作用,当前广泛应用的TNF-α拮抗剂能显著控制RA的关节炎症症状,并部分阻断滑膜增生进程就是明证；二是由于RASFs本身的细胞生物学特点发生改变,生长周期调控机制障碍,出现类似肿瘤样转化的转化细胞特征所致(主动性增生)。目前发现,激活的RASFs具有下述特点：①异常增殖类似于局限性侵袭生长的肿瘤；②体外培养丧失了接触性抑制,可形成肿瘤样的癌巢；③原癌基因高度表达,使它们能逃避正常的生长调控机制而出现过度增殖,并获得侵袭特征；④抑癌基因P53突变型高度表达,而PTEN表达显著减少,细胞凋亡受到抑制；⑤蛋白酪氨酸激酶活性大大增加,而该酶是正常细胞与肿瘤细胞相互转化的关键环节；⑥能不通过细胞因子依赖途径,仅仅是内源性逆转录分子L1引导的MAPK信号分子p38δ就能激活RASFs,并持续分泌基质金属蛋白酶,从而降解软骨；⑦长期培养的RASFs侵袭人工基质程度4倍于正常的滑膜细胞,在免疫缺陷鼠体内单纯移植培养传代的RASFs仍表现有强烈的软骨侵蚀特征,而骨关节炎和正常成纤维细胞则无此特征。这些证据表明,RASFs与正常人和其它关节炎滑膜细胞相比,其生物学特点产生了明显的转化细胞特征。RA的治疗目标近年来已逐渐集中到真正阻断滑膜增生和骨质侵蚀方向,即所谓阻断病情进展。通过阻断滑膜增生,可延缓骨质侵蚀,从而阻断RA的病情进展,达到治疗RA的目标。RA属于中医“痹病”、“历节”范畴,临床上,我们以三水白虎汤(Sanshui Baihu decoction, SSBH)治疗湿热痹阻型痹病。既往研究表明,SSBH缓解RA临床症状,改善炎症指标,并延缓和阻止X线水平RA的骨质侵袭进展。这都在大鼠胶原诱导性关节炎(CIA)模型得到证明,SSBH抑制CIA炎症发展过程中滑膜增生、纤维化、炎细胞的浸润、软骨和骨的破坏,X线照片上也明显能阻止CIA股指各关节的破坏。其作用机制包括：抑制基质金属蛋白酶(MMP-1、MMP-3)、NF-κB mRNA在关节局部的表达；抑制TNF-a的产生；该方能减少关节滑膜成纤维细胞内p38MAPK的激活,致使关节组织中p38MAPK表达降低。由于TNF-α及其在细胞内的信号转导通路p38MAPK被抑制,滑膜炎症和增生将被抑制；基质金属蛋白酶是导致软骨损伤的重要酶类,因此三水白虎汤能减轻软骨破坏。通过双向蛋白电泳技术发现SSBH抑制ASFs增殖相关的蛋白主要有IL-1Ra、OS-9、sorcin、Centrosomal等。三水白虎汤的作用机制无疑是多途径、多层次干预RA免疫炎症的反应的多个环节。既能抗炎镇痛、又能抑制免疫,同时还有一个重要的作用是抑制滑膜成纤维细胞的增生。而抑制滑膜成纤维细胞增生将成为RA治疗的主要方向,这就提示了三水白虎汤具有向阻断RA病情进展方向进行进一步研究开发的前景。噬菌体展示技术(Phage display technology)是一项将外源性的重组肽、蛋白质融合到噬菌体衣壳蛋白上的基因技术,广泛应用于药物作用靶点筛选。噬菌体展示随机肽库(phage-displayed random peptide library)的出现,将合成的随机序列的寡核苷酸片段克隆到噬菌体表面蛋白基因中,由一定长度的随机肽段混合组成的噬菌体随机肽库,理论上包含了该长度所有可能的氨基酸排列信息。用特定的靶分子通过亲和淘洗,能够高效、快速、简便地从噬菌体随机肽库中筛选到与特定靶分子结合的噬菌体肽,大大简化了蛋白质表达的筛选和鉴定。本文以差减筛选法淘选三水白虎汤抑制RASFs增殖的蛋白作用靶点,若筛选到这些靶点蛋白,将对三水白虎汤治疗RA的作用机制探讨、组方的科学精减和临床应用定位(如定位于改善病情的DMARDs药物)具有重要意义。①精确的作用靶点定位将为三水白虎汤阻断RA滑膜增生机制提供更科学的依据,并对辨证论治中药复方治疗类风湿关节炎的机制研究开拓新的思路。②今后还能以对靶点蛋白的干预强度对三水白虎汤组方进行科学加减。③若再结合临床从血清或关节滑液中检测靶点蛋白的活性,将来对三水白虎汤治疗RA的疗效判断和疗程制订均具有指标意义。同时,该研究也有可能发现RASFs增生的新机制。第一部分RASFs的分离培养及SSBH含药血清的干预目的体外分离培养RASFs,制备SSBH含药血清并干预RASFs,明确SSBH抑制RASFs增殖的最佳浓度和时间,用于下一步噬菌体筛选实验。方法1.选取临床RA膝关节受累患者的滑膜组织,组织块培养法进行原代培养,传代至3-4代用于实验研究。2.中药复方三水白虎汤含药血清的制备：煎煮SSBH并浓缩,SD鼠灌胃7天后采血离心取血清灭活除菌备用。3.直接计数法研究不同浓度(5%、10%、20%)的SSBH含药血清和处理天数(1d、3d、5d)抑制RASFs增殖的程度,并进行统计学分析。结果组织块培养法获得3株稳定的细胞株,细胞形态呈梭形,B型滑膜成纤维细胞占98%以上。直接计数法可观察SSBH含药血清浓度为10%、20%在第3天可明显抑制RASFs的增殖,最适宜浓度为20%的含药血清浓度。结论体外培养的RASFs第3代之后,细胞形态逐渐稳定,5-7天可成倍增趋势；浓度20%的SSBH含药血清在3天可明显抑制RASFs的增殖。含药血清的可靠性依赖于血清的来源、给药途径、给药剂量、采血的规范化和血清保存等条件。第二部分全细胞差减筛选SSBH干预RASFs的特异性结合短肽目的利用全细胞差减筛选法从噬菌体随机十二肽库淘选出与SSBH作用的类风湿关节炎滑膜成纤维细胞特异性结合的多肽,方法噬菌体肽库全细胞差减筛选：RASFs分别经生理盐水灌胃鼠血清和SSBH灌胃鼠血清培养后,消化收集细胞,生理盐水(NS)处理的RASFs为吸附细胞,与噬菌体肽库培育后,离心取上清液与SSBH处理的RASFs再次培育,取与细胞结合的噬菌体进行测滴度、扩增、纯化后,将扩增和纯化的噬菌体再进行下一轮差减筛选。第3轮筛选结束后,测滴度,并在IPTG/X-gal琼脂板上随机挑选32个噬菌体蓝斑进行扩增。结果SSBH处理的RASFs特异性结合的噬菌体经3轮的筛选和富集,回收率从4.0×10-5到4.6×10-3,阳性噬菌体有100倍的富集效应。结论经过3轮淘选,获得比较清晰可见的噬菌体蓝斑,全细胞差减筛选法筛选先将NS处理过的RASFs与噬菌体肽库孵育,消除了非特异性结合的噬菌体,再筛选与SSBH特异性结合短肽,处理因素只保留SSBH处理,因此可以考虑为SSBH处理差异导致的特异性结合肽的改变,此方法最主要的优势是：不用预先确定具体的目的受体,是一种寻找细胞表面未知受体及其配体分子的有效手段；与相应的细胞功能实验相结合,可以直接筛选到对某种细胞膜分子的功能及细胞表型有影响的活性肽,有利于发现其功能结构域。第三部分RASFs特异性结合短肽的测序及分析目的获得并分析SSBH干预RASFs的特异性结合短肽的序列。方法挑选32个噬菌体蓝斑进行扩增、纯化,应用M13噬菌体单链DNA抽提试剂盒制备ssDNA; DNA凝胶电泳测定DNA的抽提能否满足测序要求；送上海英潍捷基公司基因测序,测序引物为-96gⅢ5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’.对测序结果进行分析,寻找特异性结合短肽序列。结果挑选的32个噬菌体蓝斑进行蛋白电泳后,出现电泳条带；碱基序列AGTGGTGTGTATAAGGTT-GCGTATGATTGGCAGCAT特异性结合短肽蛋白序列SGVYKVAYDWQH被高度富集约为56%。结论具有一组相同序列的阳性噬菌体得到有效的富集。采用了连续的差减筛选策略,因此可以通过RASFs为靶标只筛选得到出现次数较多的一组序列,保证作用靶点的特异性结合。第四部分RASFs特异性结合短肽的亲和性初步鉴定及同源性分析目的初步鉴定淘选的特异性结合短肽的亲和力,寻找SSBH治疗类风湿关节炎的蛋白靶点,推导SSBH治疗RA的相关作用机制。方法1.噬菌体亲和力实验：测序后,选取扩增后的多肽噬菌体与细胞进行再结合实验,加HRP-anti M13抗体,利用ELISA初步验证细胞亲和力。2.同源序列分析：在美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的蛋白质序列数据库(BLAST)中查询同源序列。向SignalP3.0提交BLAST获得的人类蛋白序列数据预测分泌蛋白,向TMHMM2.0提交BLAST获得的人类蛋白序列数据,筛选出其中的跨膜蛋白。将与RASFs增生及RA病理相关,还有存在和RASFs相互作用的潜在可能性的分泌蛋白或膜蛋白、跨膜蛋白定位为候选目标功能蛋白。结果1. SSBH与NS处理的RASFs,经ELISA初步鉴定其亲和性,显示SGVYKVAYDWQH在SSBH处理的RASFs亲和力最高(OD值0.382±0.020),对照组NS亲和力(OD值0.206±0.015),p<0.05。2.将SGVYKVAYDWQH提交BLAST进行同源序列搜索,结果显示蛋白质主要为：人内脏脂肪丝氨酸蛋白酶抑制剂(Vaspin),肌微管素相关蛋白14(myotubularin-related protein14, MTMR14),肌动蛋白结合蛋白(DST protein),钙粘附蛋白(CAD protein)等。结论从噬菌体肽库筛选到SSBH作用RASFs的特异性结合短肽,并分析出相关作用蛋白。SGVYKVAYDWQH生物学分析显示该短肽相关性蛋白有Vaspin、MTMR14、BPAG1、DST、CAD等,Vaspin在RA患者血清中有高表达,对于RA的诊断也有一定的临床意义,其特异性和敏感性有待进一步研究。DST蛋白与CAD蛋白都与细胞结构、运动、迁移密切相关。CAD蛋白-11介导了RASFs的炎症和小鼠炎症关节炎模型的软骨降解,而CAD蛋白配体也是Cadherin分子,同样地,我们认为SSBH增加CAD蛋白的配体,结合胞内CAD蛋白,抑制了CAD介导的炎症进展,延缓了RA的进程。此外,是否SSBH可以干预RASFs的运动能力,影响细胞迁移,因此阻断RASFs的主动增生,仍需进一步研究。