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粘质沙雷菌属于肠杆菌科沙雷菌属，最初被认为是一种非致病性的微生物，随着相关感染病例的不断报道，现在已成为临床常见的机会性病原体。21世纪以来的几项大型研究数据表明，在世界范围的血流感染和肺部感染中，粘质沙雷菌已晋级为排名前十的临床病原微生物。在中国，随着粘质沙雷菌临床检出率的逐年升高和多重耐药粘质沙雷菌的不断出现，粘质沙雷菌引起的感染已成为临床一大治疗重点和难点。近几年本院临床检出的碳青霉烯类耐药的粘质沙雷菌(carbapenem-resistant Serratia marcescens，CRSM)已跻身为碳青霉烯类肠杆菌科细菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE)的第三位，而碳青霉烯类药物作为临床抗感染的一道重要屏障正逐渐失去其在抗感染舞台上的中心地位。为了预防多重耐药粘质沙雷菌的进一步播散和进化，促进临床感染的监控和抗生素的合理应用，本研究基于不同的分子分型研究方法对本院碳青霉烯类耐药粘质沙雷菌进行院内克隆传播的分析，并进一步探索其耐药机制。
本研究对浙江大学医学院附属邵逸夫医院2018年4月至2019年3月临床检出的75株粘质沙雷菌进行鉴定，共筛选出非重复的碳青霉烯类耐药粘质沙雷菌36株。体外药敏实验结果显示，36株粘质沙雷菌对美罗培南(Meropenem，MEM)、亚胺培南(Imipenem，IPM)和厄他培南(Ertapenem，ETP)均耐药，对头孢菌素类药物包括头孢他啶、头孢西丁、头孢吡肟、头孢噻肟均表现为耐药(其中有2株对
头孢他啶中介)，对氨曲南均表现为耐药，对环丙沙星仅1株表现为敏感，其余均为耐药。对36株粘质沙雷菌进行脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE)，并用Bionumerics软件分析得到5个不同的簇分别为A、B、C、D、E，其中A、B、C3簇可以认为是同一克隆来源(相似值>81%)，而D、E两簇各包含1株遗传背景明显不同的菌株。同时用RidomSeqSphere+软件建立了一个本地的核心基因组多位点序列分型(core genome Multiple Locus Sequence Typing, cgMLST)分型方案，得到4个不同的克隆簇分别为1、2、3、4，不同簇的等位基因差异在10个以上，其中1簇和2簇的菌株总和等于PFGE分型中的A、B、C簇的菌株总和，3簇和4簇与PFGE分型中的D簇与E簇相同。两种分型方法得到基本一致的结果，而cgMLST分型中的2簇仅包含1株细菌，将PFGE分型中的A簇中的1株细菌单独区分出来，所以cgMLST的分型结果比PFGE分型的精确度更高。结合菌株临床资料可知，碳青霉烯类耐药粘质沙雷菌在院内存在以普外科及ICU病房为主的克隆播散现象，药敏表型也支持这一观点，但不排除碳青霉烯类耐药粘质沙雷菌在院内其他地点的克隆播散可能。
在明确院内克隆分布的基础上，本研究进一步探索了36株碳青霉烯类耐药粘质沙雷菌的耐药机制。通过PCR筛查和全基因组测序分析发现，blaKPC-2是介导碳青霉烯类耐药唯一的碳青霉烯酶基因，36株碳青霉烯类耐药粘质沙雷菌中有33株菌携带该基因。S1杂交和全基因组数据分析证实，33株粘质沙雷菌均各自拥有一个携带blaKPC-2的质粒，其中32株为103kb大小，1株为94kb大小，另外3株不携带blaKPC-2的菌株均不包含相应大小质粒。接合实验证实，33株细菌中有31株的blaKPC-2质粒具有可转移性。本研究中所有质粒的blaKPC-2周围结构均属于先前报道的非Tn4401结构类型(NTEKPC)，与质粒pKPHS2(accession no.CP003224)中的结构相同，但存在C→T的点突变。同时，外膜蛋白(outer membrane protein， omp)的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfonate Polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)和blaSRT-1及blaCTX-M-14的定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)结果表明，余下3株不携带blaKPC-2菌株的碳青霉烯类耐药是由外膜蛋白的缺失和SRT-1/CTX-M-14的过表达联合介导的。外排泵抑制实验结果表明大约89%的菌株存在外排泵耐药的机制，与上述两种耐药机制共同介导了细菌对碳青霉烯类的耐药。此外，36株细菌中有35株因为携带喹诺酮类耐药基因qnrS1对喹诺酮类耐药，qnrS1耐药基因同时存在于染色体和质粒上。在blaKPC-2的基因下游约8kb处存在一个由qnrS1和ISKpn19组成的约6kb的qnrS1区，33株携带blaKPC-2质粒的菌株中有32株均包含此区。以上提示，粘质沙雷菌可能通过NTEKPC结构、qnrS1区和blaKPC-2质粒的水平转移来实现细菌向多重耐药的进化。
在36株碳青霉烯类耐药粘质沙雷菌中共追溯到7组系列菌株(一组系列菌株包括一名患者住院期间分离到的所有粘质沙雷菌)，每组2-6株不等，共21株，经PFGE证实均为同一克隆类型。其中6组各组均包含碳青霉烯类敏感和碳青霉烯类耐药的菌株，是否耐药决定于是否携带可接合的blaKPC-2的质粒，因此我们认为院内碳青霉烯类敏感的粘质沙雷菌通过获得携带blaKPC-2的质粒来获得对碳青霉烯类药物的耐药性。此外，对其中一组系列菌株的耐药机制分析表明，外膜蛋白通透性的下降联合AmpC/ESBL酶的过表达所介导的碳青霉烯类耐药机制还受到包括丝状血凝素家族外膜蛋白(FHA omp)在内的其他因子调控，有待进一步研究。
综上所述，本院过去一年里院内的碳青霉烯类粘质沙雷菌存在克隆传播现象，主要在普外科病房和ICU病房之间传播，携带含有blaKPC-2的质粒是其碳青霉烯类耐药的主要原因，而外膜蛋白突变和外排泵机制是次要原因。碳青霉烯类敏感的粘质沙雷菌可能通过获得携带blaKPC-2的质粒来获得对碳青霉烯类药物的耐药性，是多重耐药粘质沙雷菌进化的过程之一。
本研究对浙江大学医学院附属邵逸夫医院2018年4月至2019年3月临床检出的75株粘质沙雷菌进行鉴定，共筛选出非重复的碳青霉烯类耐药粘质沙雷菌36株。体外药敏实验结果显示，36株粘质沙雷菌对美罗培南(Meropenem，MEM)、亚胺培南(Imipenem，IPM)和厄他培南(Ertapenem，ETP)均耐药，对头孢菌素类药物包括头孢他啶、头孢西丁、头孢吡肟、头孢噻肟均表现为耐药(其中有2株对
头孢他啶中介)，对氨曲南均表现为耐药，对环丙沙星仅1株表现为敏感，其余均为耐药。对36株粘质沙雷菌进行脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE)，并用Bionumerics软件分析得到5个不同的簇分别为A、B、C、D、E，其中A、B、C3簇可以认为是同一克隆来源(相似值>81%)，而D、E两簇各包含1株遗传背景明显不同的菌株。同时用RidomSeqSphere+软件建立了一个本地的核心基因组多位点序列分型(core genome Multiple Locus Sequence Typing, cgMLST)分型方案，得到4个不同的克隆簇分别为1、2、3、4，不同簇的等位基因差异在10个以上，其中1簇和2簇的菌株总和等于PFGE分型中的A、B、C簇的菌株总和，3簇和4簇与PFGE分型中的D簇与E簇相同。两种分型方法得到基本一致的结果，而cgMLST分型中的2簇仅包含1株细菌，将PFGE分型中的A簇中的1株细菌单独区分出来，所以cgMLST的分型结果比PFGE分型的精确度更高。结合菌株临床资料可知，碳青霉烯类耐药粘质沙雷菌在院内存在以普外科及ICU病房为主的克隆播散现象，药敏表型也支持这一观点，但不排除碳青霉烯类耐药粘质沙雷菌在院内其他地点的克隆播散可能。
在明确院内克隆分布的基础上，本研究进一步探索了36株碳青霉烯类耐药粘质沙雷菌的耐药机制。通过PCR筛查和全基因组测序分析发现，blaKPC-2是介导碳青霉烯类耐药唯一的碳青霉烯酶基因，36株碳青霉烯类耐药粘质沙雷菌中有33株菌携带该基因。S1杂交和全基因组数据分析证实，33株粘质沙雷菌均各自拥有一个携带blaKPC-2的质粒，其中32株为103kb大小，1株为94kb大小，另外3株不携带blaKPC-2的菌株均不包含相应大小质粒。接合实验证实，33株细菌中有31株的blaKPC-2质粒具有可转移性。本研究中所有质粒的blaKPC-2周围结构均属于先前报道的非Tn4401结构类型(NTEKPC)，与质粒pKPHS2(accession no.CP003224)中的结构相同，但存在C→T的点突变。同时，外膜蛋白(outer membrane protein， omp)的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfonate Polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)和blaSRT-1及blaCTX-M-14的定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)结果表明，余下3株不携带blaKPC-2菌株的碳青霉烯类耐药是由外膜蛋白的缺失和SRT-1/CTX-M-14的过表达联合介导的。外排泵抑制实验结果表明大约89%的菌株存在外排泵耐药的机制，与上述两种耐药机制共同介导了细菌对碳青霉烯类的耐药。此外，36株细菌中有35株因为携带喹诺酮类耐药基因qnrS1对喹诺酮类耐药，qnrS1耐药基因同时存在于染色体和质粒上。在blaKPC-2的基因下游约8kb处存在一个由qnrS1和ISKpn19组成的约6kb的qnrS1区，33株携带blaKPC-2质粒的菌株中有32株均包含此区。以上提示，粘质沙雷菌可能通过NTEKPC结构、qnrS1区和blaKPC-2质粒的水平转移来实现细菌向多重耐药的进化。
在36株碳青霉烯类耐药粘质沙雷菌中共追溯到7组系列菌株(一组系列菌株包括一名患者住院期间分离到的所有粘质沙雷菌)，每组2-6株不等，共21株，经PFGE证实均为同一克隆类型。其中6组各组均包含碳青霉烯类敏感和碳青霉烯类耐药的菌株，是否耐药决定于是否携带可接合的blaKPC-2的质粒，因此我们认为院内碳青霉烯类敏感的粘质沙雷菌通过获得携带blaKPC-2的质粒来获得对碳青霉烯类药物的耐药性。此外，对其中一组系列菌株的耐药机制分析表明，外膜蛋白通透性的下降联合AmpC/ESBL酶的过表达所介导的碳青霉烯类耐药机制还受到包括丝状血凝素家族外膜蛋白(FHA omp)在内的其他因子调控，有待进一步研究。
综上所述，本院过去一年里院内的碳青霉烯类粘质沙雷菌存在克隆传播现象，主要在普外科病房和ICU病房之间传播，携带含有blaKPC-2的质粒是其碳青霉烯类耐药的主要原因，而外膜蛋白突变和外排泵机制是次要原因。碳青霉烯类敏感的粘质沙雷菌可能通过获得携带blaKPC-2的质粒来获得对碳青霉烯类药物的耐药性，是多重耐药粘质沙雷菌进化的过程之一。