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目前,大肠杆菌病主要采用抗生素治疗,长期以来,临床上滥用抗生素导致大肠杆菌广泛产生耐药性,这对鸡大肠杆菌病的防治带来了很大影响。本研究从安徽当涂地区一个疑似患有大肠杆菌病反复发作的蛋鸡饲养场采集病料进行病原菌的分离、鉴定,分析其耐药性,并从郁金散、大黄、黄芩和黄芩苷中筛选出能消除临床分离菌株耐药性的中药,为鸡大肠杆菌病的有效防治提供重要支持和可靠依据。试验Ⅰ 鸡源大肠杆菌的分离鉴定与耐药性分析采集安徽当涂地区一个疑似患有大肠杆菌病反复发作的蛋鸡饲养场的病死鸡肝脏、心脏进行病原菌的分离鉴定,经过分离培养、形态学观察、纯化扩增、生化鉴定、PCR鉴定,结果如下:在麦康凯琼脂培养基上生成湿润、光滑、整齐、淡红色的菌落;在伊红美蓝琼脂培养基上生成圆形凸起的紫黑色菌落,表面光滑且有典型金属光泽。在显微镜下观察到红色、两端钝圆、中等大小的短杆菌。2株分离菌能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖,MR试验均呈阳性、VP试验均呈阴性。PCR鉴定的结果显示,2株分离菌的phoA基因扩增产物的大小为372 bp,uid基因扩增产物的大小为293 bp,与100株已知基因序列的大肠杆菌的序列相似度都≥ 99.0%。综合判定从心脏、肝脏分离得到的病原菌均为大肠杆菌,分别简写为HE、LE。通过测定HE、LE对20种常用抗生素的药物敏感性试验来分析其耐药性,结果表明,HE、LE均表现为多重耐药,其中HE对20种抗生素耐药,LE对12种耐药,8种敏感。试验Ⅱ 郁金散及其组方药物消除鸡源多重耐药大肠杆菌对庆大霉素、环丙沙星的耐药性作用研究采用微量稀释法测定各抗菌药物、郁金散及其组方对HE、LE的最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration,MIC）,通过改良后的微量接种菌落计数法测定生长曲线来筛选各中药消除抗生素耐药性的作用浓度。在含有该浓度中药提取液的营养肉汤中对HE、LE进行耐药性消除试验,测定药物敏感性试验和MIC值来监测HE、LE药物耐药性的变化。通过棋盘稀释法测定各中药与庆大霉素和环丙沙星的联合效应。在MIC测定结果中,HE、LE的MIC值相同,郁金散、大黄、黄芩和黄芩苷的MIC 值分别为:250.0 mg/mL、250.0 mg/mL、62.5 mg/mL、2.0 mg/mL,黄芩苷的抑菌效果最好。125.0 mg/mL的郁金散、62.5 mg/mL的大黄、15.6 mg/mL的黄芩和1.0 mg/mL的黄芩苷不会影响菌株的生长,作为各中药消除抗生素耐药性的作用浓度。在各中药作用2代以后,各中药均能消除HE对庆大霉素的耐药性:HE庆大霉素耐药结果均判定为敏感,庆大霉素的MIC值从16.0 μg/mL都降到了1.0 μg/mL,HE对庆大霉素恢复的敏感性在10代以内稳定存在。在中药作用10代以后,郁金散、黄芩、黄芩苷消除了 HE对庆大霉素和喹诺酮类的药物耐药性,大黄不能消除对喹诺酮类的药性:HE喹诺酮类的耐药结果均判定为敏感,环丙沙星的MIC值在中药作用前为80.0μg/mL,各中药作用后的MIC各有不同,都降到了≤1.0μg/mL,HE对喹诺酮类恢复的敏感性在10代稳定存在。在各中药作用LE 10代,所有抗生素的耐药结果没有发生改变。联合用药的结果显示:郁金散、大黄、黄芩、黄芩苷与庆大霉素联合用药都表现为无关作用;郁金散、黄芩、黄芩苷与环丙沙星联合用药也都表示为无关作用。试验Ⅲ 郁金散及其组方药物抗多重耐药大肠杆菌感染作用首先给ICR小鼠腹腔注射109 CFU/mL的菌液。接种后每天观察记录小鼠的临床症状、死亡情况等,以确定HE的毒力,并无菌心脏采样进行细菌分离鉴定。测定HE的LD50确定接菌量后,腹腔注射大肠杆菌菌液,接种菌液后1 h给药,分为中药治疗组、联合用药组、环丙沙星组、大肠杆菌对照组、空白对照组,联合用药时两种药物分不同途径同时给药。通过分析存活率、脏器菌落总数、再分离细菌的药物敏感性、炎性细胞因子、内毒素以及脾脏病理组织学观察来判定各中药的治疗效果。结果显示,鸡源多重耐药大肠杆菌HE为高毒力,LD50的细菌量为3.98×108CFU/mL,确定动物试验的接种量为4.49×108 CFU/mL。经过郁金散、黄芩和黄芩苷治疗后,能消除HE对庆大霉素的耐药性,不能恢复对环丙沙星的敏感性。经郁金散、黄芩和黄芩苷治疗后,中药治疗组的存活率显著高于大肠杆菌对照组,能显著降低肝脏、心脏和脾脏定植的菌落总数,血清内毒素、炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6均显著性降低至正常水平,能有效地抑制脾脏的炎症;环丙沙星和联合用药的三组没有表现出治疗效果。