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蛇毒是毒蛇从毒腺中分泌出来的富含蛋白质及多肽的液体,其中蛋白质及多肽约占毒液干重的90～95%。现代药理学表明,蛇毒在细胞凋亡、神经传递、止血和信号转导等生理过程中起着关键作用,具有高活力、高靶向专一性等特点。据统计,从蛇毒中开发新药的概率是人工合成化合物的1000倍以上,其高成药性的优势导致蛇毒成为了近年新药开发的研究热点之一。然而,由于蛇毒中毒素蛋白质及多肽种类多样、含量差异大以及存在大量的翻译后修饰,蛇毒蛋白质组学的研究面临众多技术挑战。目前,任何一种单一机制的分离模式都无法满足蛇毒中所有成分的完全分离。近年来,基于蛋白质等电点和分子大小进行分离的二维凝胶电泳法（Two-dimensional gel electrophoresis technology,2-DE）,被广泛应用于蛇毒毒素的分离分析,但存在着分子量小和极端等电点的蛋白质丢失、重现性差、耗时费力、操作繁琐等一系列缺点。全二维液相色谱法（Two-dimensional liquid chromatography,2D-LC）是一种将两种分离机制的液相色谱在线组合构建起来的液相色谱技术,相比于一维液相色谱其峰容量更大、分离选择性更高,目前在蛋白质组学分离中已经卓有成效。然而,由于全二维液相色谱（Comprehensive two-dimensional liquid chromatography,LC×LC）的搭建并非简单一维液相色谱（One-dimensional liquid chromatography,1D-LC）的叠加,而是需要通过系统、深入的调制,确保第一维（First dimension,~1D）和第二维（Second dimension,~2D）在目标物分离上的独立性,以及在流动相选择上的兼容性,因此具有明显的技术壁垒,目前尚没有人针对蛇毒蛋白及多肽分离开发适用的在线全二维液相色谱系统。综上所述,本研究从分离条件、色谱组合以及二维液相系统的调制方法出发,搭建针对蛇毒毒素的在线全二维液相系统,将为蛇毒蛋白质组学、蛇毒中活性成分筛选提供可参考的技术方法及科学依据。本研究以蛋白及多肽极性和分子量差异大的尖吻蝮（Deinagkistrodon acutus）蛇毒作为模式样本,系统优化各个色谱模式的分离条件,并在此基础上选择合适的调制方法构建了两种On-line全二维液相色谱系统,从而获得对蛇毒分离具有一定普适性的全二维液相分离方法;最后,以来源于不同地域、不同科属,具有一定代表性的7种蛇毒为实际样本,系统考察方法的应用价值。第一章,概述了现阶段蛇毒蛋白组学研究中常用的分离方法,对比分析相关分离方法的优缺点,在此基础上,提出了二维液相色谱的相关概念及构建标准;简要介绍了不同模式的二维液相色谱在蛋白质组学研究中的应用,以及二维液相色谱耦联的相关调制方法;在此基础上,最后提出了本论文的研究目标、研究思路和创新点。第二章,以尖吻蝮蛇毒为样本,探讨了不同规格、不同色谱模式对于蛇毒分离的影响,获得反相液相色谱（Reversed phase liquid chromatography,RPLC）的最佳色谱柱规格以及优化了RPLC和尺寸排阻色谱（Size exclusion chromatography,SEC）的最佳分离条件。首先对比了反相色谱柱的孔径、粒径、固定相种类等对于蛇毒分离的影响;然后单独优化了RPLC的温度、酸性添加剂的浓度、流动相梯度,以及SEC的缓冲液种类,有机相含量以及温度等条件,获得了针对尖吻蝮蛇毒最佳的RPLC和SEC分离条件,并应用于七种蛇毒蛋白及多肽的分离。研究结果表明,本研究所建立的RPLC分离方法获得的峰数量较文献报道方法提高了1倍,而SEC分离方法则与文献方法基本一致;RPLC所获得的峰数量是SEC的4～10倍,两种分离模式存在显著的互补性,适合构建二维分离系统。第三章,基于上述优化的液相色谱条件,结合样品环调制器构建了适用于蛇毒分离的SEC×RPLC全二维液相色谱系统,并将其应用于4种蛇毒的分离,证实了全二维液相色谱在蛇毒分离上的可行性。以尖吻蝮蛇毒为样本,系统考察了检测器响应时间、~2D的分离温度、流速、采样时间等条件对SEC×RPLC全二维液相色谱系统分离效果的影响。从分离的结果上看,样品环调制器适用于构建SEC×RPLC全二维液相系统,所获得的峰数量是SEC的1～2倍,充分说明了基于两种正交分离机制组合而成的二维液相色谱在复杂蛇毒分离上蕴含着巨大潜力。第四章,为了进一步提升全二维液相色谱系统的分离选择性,以尖吻蝮蛇毒为样本,构建了一个基于第一维和第二维不同酸碱性条件的在线RPLC×RPLC全二维液相色谱系统,比较了~2D在固定梯度模式和平行梯度模式下对蛇毒分离的影响,最终应用于广西产银环蛇（Bungarus multicinctus）蛇毒的分离。研究结果表明,相比于固定梯度模式,平行梯度所获得的二维图峰覆盖面积更大。从分离尖吻蝮蛇毒得到的峰数量可知,RPLC×RPLC相比SEC×RPLC可多得到57个色谱峰,有望在蛇毒蛋白组学研究和蛇毒活性成分筛选中发挥更大的作用。第五章,对本文的研究结果以及不足进行了系统性总结,并在此基础上就全二维液相色谱法在蛇毒分析中的应用前景进行了展望。