论文部分内容阅读
自2004年禁止使用五溴联苯醚混合物阻燃剂以来，有机磷阻燃剂(organophosphorus flame retardants,OPFR)作为替代品开始被广泛生产和使用。有机磷阻燃剂在水体环境及生物体中的检出率越来越高，而其对生物体及生态环境的潜在毒性效应还知之甚少。 对于处于食物链顶端的水生哺乳动物如中华白海豚而言，肾脏对于其正常生理活动具有重要的意义，不仅可以维持水、酸碱及电解质平衡，还具有内分泌功能，可清除体内代谢废物及外界毒物，因此研究有机磷阻燃剂对水生哺乳动物肾脏的毒理效应，对于评估阻燃剂的环境效应具有重要的意义。鉴于目前无法在中华白海豚体内进行活体实验，也未有成熟的中华白海豚肾脏细胞系，所以我们选有陆生代表性哺乳动物大鼠的肾小管上皮细胞作为我们实验的研究对象。 本研究利用磷酸三(2,3-二氯丙基)酯(tri(2,3-dichloropropyl)phosphate, TDCPP)对大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)的毒性暴露实验，研究TDCPP对细胞活性及基因表达变化情况，来探讨TDCPP是否具有引起肾小管上皮细胞发生上皮间充质转换(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的生物毒性，进而对环境保护工作提供基本的实验数据。 研究结果表明： 1、TDCPP影响NRK-52E细胞的形态，如使细胞变圆，染色质发生固缩；抑制细胞活性，细胞活性检测实验结果表明，NRK-52E细胞经TDCPP暴露处理12、24、36、48、60、72h后，TDCPP对细胞活性的有效半数抑制浓度IC50分别为60.58、25.72、17.20、6.55、4.64、1.78μM，随着TDCPP对NRK-52细胞作用时间的延长，IC50不断降低； 2、TDCPP可以诱导NRK-52E细胞内活性氧自由基生成量增加，形成氧化应激反应，破坏细胞原有的活性氧自由基生成与清除之间的平衡状态。过量的活性氧可以通过丝裂原活化蛋白激酶信号通路和c-Jun氨基末端激酶信号通路诱导下游转化生长因子-β1的生成，促进细胞外基质成分的过度积累，进而导致纤维化； 3、50μM TDCPP暴露处理72h，NRK-52E细胞转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）mRNA的诱导表达量是空白对照组的149％，而对TGF-β1受体mRNA的诱导量是空白对照组的246%。TGF-β1不仅可以诱导细胞凋亡过程的发生，还可以活化处于静止状态的间充质成纤维细胞，促进上皮细胞向肌成纤维细胞的分化过程，通过与其膜受体结合，通过TGF-β/SMAD信号通路诱导上皮-间充质转换，促进纤维化发生； 4、TDCPP可以诱导上皮细胞发生上皮-间充质转换，TDCPP抑制在上皮细胞中起粘附作用的上皮细胞钙粘蛋白及紧密连接蛋白-1（fibronectin-1,FN-1） mRNA的表达量，50μM TDCPP在六个时间阶段内的暴露处理对上皮钙黏蛋白（E-cadherin）mRNA的表达都有显著的抑制效果，平均仅为空白对照组的22.7%，50μM TDCPP暴露处理72h后紧密连接蛋白（zonula occludens-1, ZO-1）mRNA的表达量为空白对照组的50.7%；对于间充质波形蛋白的mRNA而言，50μM TDCPP暴露处理72h后的表达量为空白对照组的301%。上皮-间充质转换过程中生成大量的间充质细胞，使纤维化过程加重； 5、50μM TDCPP暴露处理72h后α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）的表达量为空白对照组的133%；α-SMA是肌成纤维细胞的标志分子，其表达上调，表明肌成纤维细胞被活化，进一步产生纤维化细胞。 6、TDCPP还可以破坏胞外基质的稳定性，诱导FN-1 mRNA的表达量，促进其过度沉积，导致纤维化的发生；同时，几乎完全抑制了Ⅰ型胶原蛋白（collagen1,Col1）和Ⅲ型胶原蛋白（collagen3,Col3）mRNA的表达，破坏了细胞之间的紧密连接和稳定的微环境。 上述研究结果表明，TDCPP可能影响NRK-52E上皮细胞的细胞活性，减低上皮细胞之间的黏连性和完整性，诱导上皮间充质转换，促进纤维化的发生。本研究通过TDCPP的肾脏毒性阐述了TDCPP对于生物的危害性，为进一步客观全面地评估TDCPP的生物和环境毒理效应提供了基础实验数据。