论文部分内容阅读
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性、系统性、自身免疫性疾病，其主要病理特点是滑膜细胞增生，衬里层增厚，多种炎性细胞浸润，血管翳形成，继而引起软骨和骨组织的破坏，最终导致关节畸形和功能丧失。目前治疗RA的药物可分为非甾体抗炎药、甾体抗炎药和慢作用抗风湿药。由于RA的病因和发病机制仍不甚明了，临床应用受到限制。寻找安全、有效、毒副作用小的治疗RA的中药是今后研究的重要方向之一。中药木瓜为蔷薇科植物贴梗海棠(Chaenomeles speciosa[sweet] Nakai)，主要成分为苷类化合物等，中医临床主要用于痹证等。大鼠胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)是兼有体液免疫和细胞免疫变化的慢性系统性免疫性炎症，与RA有许多共同的组织学和免疫学特征，是筛选和研究治疗RA药物的较理想模型。鸟苷酸结合蛋白(Guaninenucleotide-binding protein)，简称G蛋白，在信息跨膜传递中起连接受体与效应器的枢纽作用，G蛋白的水平及活性变化对维持和控制细胞正常状态有重要的作用。本课题在建立大鼠CIA模型的基础上，采用安徽道地药材木瓜，经现代工艺提取木瓜苷(glucosides of chaenomeles speciosa，GCS)，从整体、器官、细胞、分子、信使RNA基因表达等不同层次研究了GCS对CIA大鼠的抗炎和免疫调节作用及其与滑膜细胞G蛋白偶联信号转导的关系，并对其部分机制进行了探讨，为开发和利用木瓜资源，提供理论依据。 1．GCS体内给药对大鼠CIA炎症和免疫反应的影响 应用异源性鸡Ⅱ型胶原(CC Ⅱ)和弗氏不完全佐剂(FIA)建立大鼠CIA模型，用足爪仪测量足爪肿胀度(△ml)，同时采用O—4级评分法进行关节评分；检测安徽医科大学博士学位论文体重变化情况(△g);测定大鼠胸腺指数和脾指数;用ELISA法检测CIA大鼠抗CCH抗体;用螺旋测微计测量两耳厚度之差(△InIn)观察CIA大鼠对CCll的迟发型变态反应:用H&E染色的方法观察病理组织学改变;结果发现CIA大鼠炎症和免疫反应表现为足爪肿胀和多发性关节炎;体重和免疫器官(胸腺和脾)减轻;体内产生抗Cn抗体和对CCll的迟发型变态反应;其病理组织学显示炎性细胞浸润、滑膜增厚、关节软骨破坏，与人RA类似，Ges 30、60、rZomg·kg一，(19)x7d均能明显减轻CIA大鼠足爪肿胀和多发性关节炎，缓解体重和免疫器官(胸腺和脾)重量的异常变化;对CIA大鼠抗CCll抗体无明显作用;可显著抑制C IA大鼠的迟发性变态反应;GCS可明显减轻异常的病理组织学变化，对CIA大鼠病变关节的病理组织结构有明显的改善作用。2 GCS体内、体外给药对CIA大鼠免疫细胞和细胞因子的作用 采用咐T法检测胸腺、脾淋巴细胞增殖反应;用活化的小鼠脾淋巴细胞MTT比色法检测胸腺淋巴细胞产生的IL一2的活性;采用ConA诱导的小鼠胸腺淋巴细胞MTT参入法检测腹腔巨噬细胞产生的IL一1的水平;采用生物学方法检测腹腔巨噬细胞产生的TNF一Q的活性;结果表明CIA大鼠ConA诱导的胸腺T细胞增殖反应和工L一2的产生显著增高，LPS诱导的脾B细胞增殖反应无明显变化;腹腔巨噬细胞产生的IL一1和TNF二a的活性明显升高。Ges 30、60、1 20mg·kg一L(19)X 7d和体外0.5、2.5、12.5、62.5、125 mg·L一‘不同浓度可抑制CIA大鼠过高的胸腺T细胞增殖反应和IL一2的产生;对于腹腔巨噬细胞儿一1、TNF一Q的过度产生也有抑制作用。3 GcS体内、体外给药对CIA大鼠滑膜细胞增殖及其分泌功能的影响 RA早期的病变位于滑膜，其滑膜细胞功能的改变直接影响RA病理进程。原代培养细胞离体时间短，其生物学特性和遗传性基本与体内相似，无自发性变异，是细胞形态、机能、分化等研究的理想材料。本文采用MTT法检测滑膜细胞的增殖反应:采用ConA诱导的小鼠胸腺淋巴细胞MTT参入法检测滑膜细胞产生的IL一1的水平;采用生物学方法检测滑膜细胞产生的TNF一Q的活性;结果表明CIA大鼠滑膜细胞的增殖反应升高;滑膜细胞产生的IL一1和TNF一。的活性明显升高。GCS安徽医科大学博士学位论文30、60、120mg·kg一，(19)X 7d和体外0.5、2.5、12.5、62.5、125 mg·L一，不同浓度可抑制CIA大鼠过高的滑膜细胞的增殖反应;对于滑膜细胞工L一1、TNF一a的过度产生也有抑制作用。4 GcS体内给药对CIA大鼠滑膜细胞丁N卜amRNA表达的影响 本研究采用RT一PCR方法，进一步研究了GCS对滑膜细胞TNF一a mRNA表达的影响。结果表明，CIA大鼠滑膜细胞TNF一Q mRNA表达明显增强，且发现GCS能明显抑制CIA大鼠滑膜细胞TNF一a mRNA表达。5.GCS对CIA大鼠炎症免疫反应的作用与调节滑膜细胞G蛋白偶联信号转导的关系 为了探讨GCS对CIA大鼠炎症免疫反应的作用与调节滑膜细胞G蛋白偶联信号转导的关系，本研究采用RT一PCR方法检测CJA大鼠滑膜组织G蛋白mRNA的基因表达。研究发现，CIA大鼠滑膜细胞的Gi蛋白mRNA的水平明显高于正常对照组，Gs蛋白mRNA的水平低于正常对照组;GCS可以上调Gs蛋白mRNA水平，而下调Gi蛋白mRNA水平。CIA大鼠滑膜细胞内cAMP含量较正常大鼠明显下降，Ges体外0.5、2.5、12.5、62.5、125 mg·L一，不同浓度均能升高滑膜细胞内eAMp含量，相关分析结果显示，GCS升高CI