【摘 要】
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Streptomyces netropsis DSM 40846因能产生多种抗生素,包括聚酮类抗生素金链菌素、吡咯酰胺类抗生素偏端霉素A和刚果菌素等而得到广泛关注。全基因组序列的生物信息学分析发现该菌中还存在着大量未知功能的天然产物生物合成基因簇,包括多个PKS、NRPS和Ri PP类基因簇,具有基因组挖掘的潜力。本研究采用基因组挖掘策略对S.netropsis DSM 40846基因组中潜在的天
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Streptomyces netropsis DSM 40846因能产生多种抗生素,包括聚酮类抗生素金链菌素、吡咯酰胺类抗生素偏端霉素A和刚果菌素等而得到广泛关注。全基因组序列的生物信息学分析发现该菌中还存在着大量未知功能的天然产物生物合成基因簇,包括多个PKS、NRPS和Ri PP类基因簇,具有基因组挖掘的潜力。本研究采用基因组挖掘策略对S.netropsis DSM 40846基因组中潜在的天然产物生物合成基因簇展开研究。通过anti SMASH分析软件在S.netropsis DSM 40846基因组序列中预测到40个潜在的天然产物生物合成基因簇,其中PKS、NRPS和Ri PP基因簇有22个,可能合成具有生物活性的天然产物。构建S.netropsis DSM 40846的基因组cosmid文库,结合前期实验室构建的BAC文库,通过PCR筛选的方法获得包含18个天然产物生物合成基因簇的阳性克隆子。利用接合转移将阳性克隆子导入异源宿主菌S.lividans或S.albus中进行表达。采用生物活性测定和TLC检测异源表达菌株的代谢产物,发现5个基因簇有异源表达产物产生。以下是这5个基因簇的研究内容。偏端霉素A的生物合成基因簇分散在两个不同的区域part1和part2,只有将两个部分共同在一个宿主中表达才能合成偏端霉素A。首先将包含基因簇两个部分的阳性克隆子16H5和18H11从文库中筛选出来,然后通过载体改造,使得part1和part2分别由两个可以相容的载体p MSB152B和p WHM4S携带进入异源宿主菌S.albus中进行共表达,成功获得能够产生偏端霉素A的异源表达菌株。基因簇cluster21-1与套索肽citrulassin B生物合成基因簇高度同源,推测其产物极有可能是citrulassin B。将基因簇cluster21-1的阳性克隆子3B8导入异源表达宿主菌S.albus中,异源表达菌株S.albus::3B8对金黄色葡萄球菌产生显著的抑制作用,HPLC检测的结果也表明有异源表达产物产生。基因簇cluster11-2与异呋喃萘醌生物合成基因簇的同源性高。含有该基因簇的异源表达菌株S.albus::1H9和S.albus::3E1可以产生特殊的红棕色色素物质,在365nm的紫外光下呈现橙黄色荧光。TLC检测到至少有3个不同的组分,而HPLC分析进一步确定了这些色素物质的紫外特征吸收峰,通过LC-HR-MS检测获得它们的质荷比和可能的分子式,结合异呋喃萘醌类化合物的结构特征对异源表达产物的结构进行了初步的推测。Ⅰ型聚酮合酶生物合成基因簇cluster15-1和cluster8-1与已知基因簇的同源性较低,有潜力合成新的聚酮类化合物。利用TLC和HPLC分析在这两个基因簇的异源表达菌株中找到了可能的异源表达产物,而LC-HR-MS分析进一步确定了产物的质荷比。我们分析S.netropsis DSM 40846的基因组发现了40个天然产物生物合成基因簇,从基因组文库中筛选出18个PKS、NRPS或Ri PP类生物合成基因簇的阳性克隆,分析代谢产物证实其中5个基因簇产生了异源表达产物,为新型天然产物的发现和结构解析提供了基础。
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