草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus,SVBV）属于花椰菜花叶病毒属,本实验室已证明SVBV P1蛋白是移动蛋白,在病毒的转移和扩散过程中起到关键作用,但P1蛋白如何与植物蛋白互作从而影响病毒的扩散目前还不清楚。本研究构建草莓cDNA酵母文库,以P1蛋白为诱饵从草莓cDNA文库筛选出与其互作的寄主因子。本研究以P1蛋白为诱饵蛋白筛选感染SVBV森林草莓的酵母cDNA文库,获得与其互作的寄主因子叶绿素a/b结合蛋白LHC Ⅱ,利用酵母双杂交实验（Y2H）、双分子荧光互补实验（BiFC）、pull-down实验、Co-IP实验验证P1蛋白和LHC Ⅱ蛋白互作,借助PVX运动缺陷型载体验证LHC Ⅱ蛋白能够促进P1蛋白协助病毒的胞间扩散,进一步探明SVBV与森林草莓互作的分子机理提供理论依据。1.利用酵母双杂交系统筛选与SVBV P1蛋白互作的寄主因子pGBK-P1诱饵蛋白质粒和森林草莓cDNA文库共转化酵母菌,涂布到SD/-Trp/-Leu和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/-Gluc培养基上,选取长势良好的蓝色酵母斑,提取酵母质粒,转化,筛选阳性,测序。将测序结果在NCBI网站中Blast比对,发现15种寄主因子中,有3种寄主因子的筛选丰度较高,其中就有叶绿素a/b结合蛋白（LHC Ⅱ）基因。说明LHC Ⅱ与P1关系较为密切,具有较高的研究价值。2.Real-time RT-PCR分析森林草莓LHC Ⅱ基因的RNA积累水平森林草莓接种SVBV侵染性克隆,提取森林草莓总RNA,内参为森林草莓Actin基因,real-time RT-PCR分析森林草莓LHC Ⅱ基因的mRNA表达水平。实验表明,感病森林草莓LHC Ⅱ基因的RNA积累水平上升,达到健康草莓的0.5倍。结果说明感病森林草莓中LHC Ⅱ基因能够大量表达。3.P1和LHC Ⅱ亚细胞定位及共定位pCAM-P1-GFP和pCAM-LHC Ⅱ-mCherry分别浸润本氏烟叶片,结果发现,融合蛋白P1-GFP主要形成绿色点状分布在细胞质和细胞边缘,而融合蛋白LHC Ⅱ-mCherry的红色荧光主要分布在细胞核和细胞边缘。pCAM-P1-GFP和pCAM-LHC Ⅱ-mCherry共浸润本氏烟叶片,结果发现,融合蛋白P1-GFP绿色点状和融合蛋白LHC Ⅱ-mCherry红色荧光能够在细胞边缘重合,说明两者能够共定位。4.酵母双杂（Y2H）验证P1与LHC Ⅱ互作pGBK-P1+pGAD-LHC Ⅱ、pGBK-LHC Ⅱ+pGAD-P1,分别共转化酵母菌;涂布于SD/-Ade/-His和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/培养基。实验发现,BK-P1+AD-LHC Ⅱ、阳性对照能够长斑,其他处理组均不能长斑。说明P1和LHC Ⅱ能够在体外互作。5.双分子荧光互补（BiFC）验证P1与LHC Ⅱ互作YFP^n-P1/YFP^c-LHC Ⅱ、YFP^n-LHC Ⅱ/YFP^c-P1,浸润本氏烟叶片,结果发现,YFP^n-LHC Ⅱ/YFP^c-P1和YFP^n--4A+YFP^c-P2黄色荧光亮度很强,但YFP^n-LHC Ⅱ/YFP^c-P1叶片气孔也有黄色荧光,YFP^n-P1/YFP^c-LHC Ⅱ只在单个细胞内有荧光,其他处理组均无黄色荧光。说明P1和LHC Ⅱ能够在本氏烟体内互作。6.免疫共沉淀（Pull-down）验证P1与LHC Ⅱ互作MBP-P1蛋白和LHCII-flag蛋白混合,加入flag珠子,洗脱珠子上结合的多余蛋白,western blot检测洗脱的蛋白。实验结果表明,当LHCII-flag和MBP-P1两个融合蛋白混合,检测flag挂出的蛋白,能够检测到MBP-P1蛋白,说明两者在体外存在互作。其他处理组仅带有flag标签的蛋白,而不能检测到MBP标签的蛋白,说明它们之间不存在互作。说明P1与LHC Ⅱ蛋白能够在体外互作。7.免疫共沉淀（Co-IP）验证P1与LHC Ⅱ互作myc-P1和LHCII-flag共浸润本氏烟。将融合蛋白混合,加入flag珠子,洗脱珠子上结合的多余蛋白,western blot检测洗脱的蛋白。实验结果表明,当LHCII-flag和myc-P1两个融合蛋白混合,检测flag挂出的蛋白有myc-P1蛋白,说明两者在体内存在互作。其他处理仅带有flag标签的蛋白,而不能检测到myc标签的蛋白,说明它们之间不存在互作。说明P1与LHC Ⅱ蛋白能够在体内互作。8.LHC Ⅱ蛋白的表达能帮助P1蛋白促进病毒局部扩散PVX（?P25）-GFP(OD₆₀₀=0.001),PVX（?P25）-GFP(OD₆₀₀=0.001)/pCAM(OD₆₀₀=1.0),MMA,PVX（?P25）-GFP(OD₆₀₀=0.001)/P25(OD₆₀₀=1.0),PVX（?P25）-GFP(OD₆₀₀=0.001)/pCAM–myc-P1(OD₆₀₀=1.0),PVX（?P25）-GFP(OD₆₀₀=0.001)/pCAM–myc-P1(OD₆₀₀=1.0)/pCAM–flag-LHC Ⅱ(OD₆₀₀=1.0)浸润本氏烟叶片,共聚焦观察。实验结果表明,PVX（?P25）-GFP(OD₆₀₀=0.001)/PVX（?P25）-GFP(OD₆₀₀=0.001)/pCAM(OD₆₀₀=1.0)只有单个细胞有绿色荧光,PVX（?P25）-GFP(OD₆₀₀=0.001)/P25(OD₆₀₀=1.0)许多细胞有绿色荧光,说明P25能回补病毒的移动蛋白功能,PVX（?P25）-GFP(OD₆₀₀=0.001)/pCAM–myc-P1(OD₆₀₀=1.0)3-4个细胞有绿色荧光,说明P1能够回补病毒移动的功能,PVX（?P25）-GFP(OD₆₀₀=0.001)/pCAM–myc-P1(OD₆₀₀=1.0)/pCAM–flag-LHC Ⅱ(OD₆₀₀=1.0)许多细胞有绿色荧光,说明LHC Ⅱ蛋白能够促进P1蛋白,协助病毒扩散。