牛奶是最佳的食物来源之一,富含多种营养物质和生物活性物质,对消费者的营养和健康发挥着重要作用。然而,牛奶容易在挤奶、运输、储存和加工过程中受到微生物的污染,这对乳及乳制品的质量和安全构成严重威胁。本研究利用16S rRNA基因测序和Source Tracker分析模型对牛场中的微生物进行风险关键点分析,利用培养法和Pac Bio测序技术对不同地区生乳中的嗜冷菌多样性进行分析,对不同地区生乳中分离出的假单胞菌进行功能基因的验证,利用全基因组测序对假单胞菌进行功能基因的分析。主要研究结果如下:1.生乳中微生物风险关键点分析利用16S rRNA基因测序分析了生乳中存在的微生物群落结构与饮用水、奶杯、药浴杯、乳头皮肤、奶厅空气、牛舍空气、饲料、垫料和粪便样品之间的差异。郑州牛场的生乳中不动杆菌和假单胞菌在属水平上的相对丰度较高,嗜冷菌的相对丰度占比高达95.9%,而在齐齐哈尔牛场中属水平上埃希氏-志贺氏菌和沙雷氏菌的相对丰度较高,嗜冷菌的相对丰度占比达35.1%。利用16S rRNA基因测序和Source Tracker分析模型对中国黑龙江和河南地区牛场的生乳、饮用水、奶杯、药浴杯、乳头、奶厅空气、牛舍空气、饲料、垫料和粪便等10个风险关键点的样品进行分析,发现在郑州牛场和齐齐哈尔牛场,奶杯和药浴杯分别是造成生乳样品微生物污染最主要的风险关键点。2.不同地区生乳中嗜冷菌的多样性采用传统培养和Pac Bio单分子实时测序相结合的方法调查了中国黑龙江、内蒙古、甘肃、河南、安徽、江苏、重庆和湖南省生乳中嗜冷菌的群落结构和多样性,通过传统培养法发现分离出的嗜冷菌群落结构复杂,由21属59种组成,假单胞菌属占总属的58.9%,在种水平上Pseudomonas azotoformans占比为16.9%。通过传统培养构建生乳嗜冷菌菌株数据库和Pac Bio单分子实时测序方法相结合,发现黑龙江和内蒙古地区生乳中嗜冷菌的群落结构和多样性相似,但与其他地区差异显著。此外,不同取样日期的河南生乳样品、安徽生乳样品和江苏生乳样品存在显著差异。因此,必须根据区域和季节实施不同的控制策略。3.不同地区生乳中假单胞菌的多样性及其蛋白酶活力的鉴定从中国黑龙江、内蒙古、甘肃、河南、安徽、江苏、湖南和重庆等地生乳中分离出假单胞菌116株,60.3%的假单胞菌携带apr X基因,在4°C条件下68.9%的假单胞菌菌株具有蛋白水解能力,在10°C条件下81.9%的假单胞菌菌株具有蛋白水解能力,在25°C条件下85.3%的假单胞菌菌株具有蛋白水解能力,且不同地区蛋白水解酶活力存在差异,此外,产生的蛋白水解酶具有很强的耐热能力。4.生乳中假单胞菌的全基因组测序及分析我们利用全基因组测序技术分析了生乳中假单胞菌的基因功能,耐药和蛋白酶水解活力特征。假单胞菌P1、P2、P3、P3、P4、P5、P6、和P7分别被鉴定为布氏假单胞菌、浅黄色假单胞菌、荧光假单胞菌、浅黄色假单胞菌、荧光假单胞菌、荧光假单胞菌和莓实假单胞菌。在所有假单胞菌中都含有蛋白酶基因和耐药基因,高蛋白酶水解活力的假单胞菌中含有更多的碳水化合物转运与代谢功能基因、信号转导机制基因、次级代谢产物的合成、转运与代谢基因、多糖裂解酶基因和糖类酯解酶基因,多重耐药指数也高于低蛋白酶水解活力组的假单胞菌。本研究可以为蛋白酶水解基因的检测和降低耐药基因的传播风险提供数据支撑,为提高乳及乳制品的品质提供依据。