三角帆蚌贝壳hic基质蛋白基因的克隆鉴定及功能初探

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三角帆蚌(Hypriosis cumingii)是中国重要的淡水育珠蚌,所产珍珠在总产量中的比值较大(约80%)。贝壳及珍珠钙化层中有机基质的重要成分基质蛋白在调控无机矿物碳酸钙的晶貌和晶型等方面发挥着重要作用。因此,鉴定和研究其功能对理解贝壳形成机理及提高珍珠质量具有重要的意义。本实验从三角帆蚌中分离得到3个与贝壳钙化相关的基因,并通过分子手段探究了其在矿化过程中的生物学功能。  1. 从三角帆蚌外套膜组织中克隆得到三个基质蛋白基因(hichin、hic14、hic19)。通过序列分析、结构预测、组织定量、原位杂交以及接得到hichin基因全长为645bp,其中543bp为开放阅读框,编码180aa,理论等电点(pI)4.63,预测分子量(Mw)20.3kDa,包含一个ChtBD2各时期珍珠囊组织荧光定量,对其功能进行了研究。RACE实验后拼结构域,预测蛋白高级结构与无脊椎动物几丁质结合蛋白有高度相似性。Hic14全长586bp,456bp为开放阅读框,编码151aa,pI 6.32,Mw 14.5kDa,序列中存在GS、GSG、SGS重复序列。Hic19全长1127bp,579bp为开放阅读框,编码192aa,pI 9.72,Mw 19.6kDa,且序列中存在大量碱性氨基酸(Lys、Arg)。3个基因均在外套膜组织中特异性表达,且均在外套膜缘膜部上皮细胞中检测到了强烈的信号,推测3个基因都可能参与调控贝壳棱柱层以及珍珠层矿化。  2.无核珍珠矿化可分为碳酸钙无序和有序沉积等两个阶段。在插片实验中,hichin在碳酸钙原始累积阶段出现高表达,推测hichin参与矿化过程中有机框架构建。Hic14和hic19的表达量在晶体有序沉积时显著性提高,推测hic14和hic19参与调控珍珠珍珠层生长形成过程。  3. 在RNA干扰实验中,注射dsRNA后外套膜荧光定量hichin、hic14、hic19和hic52四个基因表达量都出现明显下降,进行SEM观察后推测hichin与几丁质结合参与贝壳矿化过程中有机框架的构建,其他3个基质蛋白基因对棱柱层结构无明显影响,只对贝壳珍珠层矿化有影响,推测可能与珍珠层晶体生长、形貌有关。
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