研究目的观察散寒除湿、祛瘀通络中药复方新痹痛灵对EAM大鼠心脏损害的影响。揭示EAM大鼠心肌病变、心功能变化与TLR4/MAPK/NF-KB信号通路与炎症相关的CAMKII信号通路之间的关系。阐明新痹痛灵对心肌细胞TLR4/MAPK/NF-KB信号通路及CAMKII信号通路的调控机制,寻找中药治疗的分子靶点,为中医药治疗类风湿关节炎(RA)心脏损害提供实验依据。研究方法选用SPF级雌性Lewis大鼠,并随机分为正常对照组、EAM组、甲氨蝶呤组及新痹痛灵高剂量组、新痹痛灵中剂量组、新痹痛灵低剂量组。除正常对照组外,其余五组均采用多肽免疫大鼠的方法制备自身免疫性心肌炎模型(EAM),免疫10d后开始给药,连续4周。新痹痛灵低、中、高剂量组各按照生药量2.75 g/kg,5.5 g/kg,11g/kg大鼠体重灌胃;甲氨蝶呤组灌胃给予浓度为0.lmg/ml的甲氨蝶呤混悬液以1Oml/kg大鼠体重灌胃,每周一次;正常对照组、EAM组灌服同等体积的消毒饮用水,每日一次。干预期间,观察大鼠的一般情况,对大鼠进行体重测量和关节炎指数评价,并用游标卡尺对足趾厚度进行测量。治疗28d,采用超声心动图(UCG)评估心脏结构和功能。麻醉取血后,处死大鼠,收集组织器官。采用血清学检测心肌酶和肌钙蛋白水平;采用酶联免疫吸附法(ELISA法)检测血清IL-17,IL-6,TNF-a致炎因子的含量;采用苏木精—伊红(HE染色法)、胶原纤维染色法(Masson三色染色法)观察大鼠心肌及踝关节滑膜的组织病理学改变;采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记技术(TUNEL染色法)检测心肌细胞凋亡率;采用免疫组化法检测大鼠心肌Bcl-2,Bax和Caspase-3凋亡基因的表达;实时荧光定量(qRT-PCR法)检测大鼠心肌TLR4、P38MAPK、NF-κB/P65、TNF-α、IL-6 mRNA水平;免疫印迹法(WB)检测大鼠心肌总蛋白TLR4、My D88、P-P38MAPK(磷酸化P38MAPK)、NF-κB/P-P65(磷酸化P-P65)蛋白表达、心肌钙泵CAMKII、PLB、P-PLB、SERCA2蛋白表达、心肌核蛋白P-P3 8MAPK、NF-κB/P-P65、IRF3蛋白表达及滑膜组织中TLR4、P-P38MAPK(磷酸化P38MAPK)、NF-κB/P-P65(磷酸化P-P65)蛋白表达。研究结果1.EAM组大鼠模型的评估:①EAM组大鼠出现少动,倦怠,易激惹;体重增长较正常对照组明显缓慢,所有大鼠均出现踝关节肿胀,足部溃疡。②37天超声检查:与正常对照组相比,EAM组大鼠左室收缩末期内径LVIDs与左室收缩末容积LVVs增大(P<0.01),提示左心室腔增大,部分大鼠出现心包积液,反映心脏舒缩功能的指标二尖瓣舒张早期血流峰值(E)/舒张晚期血流峰值(A)、左室短轴缩短率FS、左室射血分数LVEF均有降低,提示心脏舒缩功能下降。③HE染色:EAM组大鼠心肌纤维排列疏松,间质区域及肌束间可见大量炎细胞浸润,间质间有小血管扩张充血,小血管周围及肌束间见有絮状纤维素渗出,有少量心肌发生脂肪变性。④Masson染色:EAM组大鼠肌纤维之间的距离增大,心肌间质和血管周围胶原纤维显著增生。⑤TU-NE1染色:EAM组大鼠心肌细胞Tunel染色阳性细胞较正常对照组大鼠明显增加。⑥免疫组化测大鼠心肌Bcl-2,Bax和Caspase-3凋亡基因的表达:与正常对照组比,EAM组Bcl-2表达下调,Bax、Caspase-3表达上调。⑦血清学检测超敏肌钙蛋白I(hs-cTnl):EAM组hs-cTnl显著增高、为阳性;⑧ELISA法测定血清细胞因子TNF-α、IL-6、IL-17:与正常对照组相比,EAM组炎性因子TNF-α、IL-17、IL-6的含量均增多(P<0.05)。综上所述,根据大鼠的症状、影像学、病理学评估证实EAM造模成功。2.新痹痛灵对心肌炎症、心肌损伤和心功能的影响:①与EAM组相比,新痹痛灵各剂量组大鼠的E/A、EF、FS均明显升高(P<0.05,0.01),甲氨蝶呤组大鼠的E/A、EF明显升高(P<0.05,0.01),提示给药后新痹痛灵各剂量组及甲氨蝶呤组均可有效改善EAM大鼠舒缩功能;新痹痛灵中、高剂量组LVVs、LVIDs明显减小(P<0.05,0.01);提示给药后新痹痛灵中、高剂量组可抑制左心室扩大。与正常对照组相比,新痹痛灵中、高剂量组大鼠的E/A、EF、FS及LVVs、LVIDs差异无统计学意义,而新痹痛灵低剂量组和甲氨蝶呤组大鼠的EF、FS稍低,LVIDs、LVVs稍较大(P<0.05),提示给药后新痹痛灵中、高剂量组大鼠的左心室腔大小、左室功能接近正常水平,而新痹痛灵低剂量组和甲氨蝶呤组大鼠的左心室腔虽有缩小,左室功能虽有所好转,但未恢复至正常水平。②HE染色:四治疗组病理组织学变化介于正常对照组和EAM组之间。其中,新痹痛灵中、高剂量组间质区域及肌束间炎症细胞浸润数量较EAM组明显减少,心肌组织变性坏死得以缓解。③Masson染色:新痹痛灵中、高剂量组及甲氨蝶呤组胶原纤维增生程度较EAM组明显减轻,心肌组织纤维化得到缓解。④TUNE1染色:新痹痛灵组的大鼠心肌细胞阳性染色数明显少于EAM组,以新痹痛灵高剂量组最明显。⑤免疫组织化学染色显示:与EAM组比,甲氨蝶呤组Bcl-2表达下调,而新痹痛灵各剂量组表达均上调,并具有剂量依赖性;新痹痛灵各剂量组及甲氨蝶呤组Bax表达均下调,其中新痹痛灵高剂量组有显著性差异;甲氨蝶呤组Caspase-3表达下调,新痹痛灵的低、中剂量组表达有下调趋势,其中高剂量组表达下调具有显著性差异。⑥血清学检测超敏肌钙蛋白I:新痹痛灵中剂量组hs-cTnI浓度低于EAM组(P<0.05),提示新痹通灵中剂量对心肌起到明显的保护作用。⑦ELISA法测定血清细胞因子TNF-α、IL-6、IL-17:与EAM组相比,新痹痛灵高、中剂量组及甲氨蝶呤组中TNF-α、IL-17、IL-6的含量均降低(P<0.05)新痹痛灵低剂量组TNF-α的含量降低(P<0.05)。提示新痹痛灵具有抑制炎症因子分泌的作用。3.新痹痛灵对大鼠关节炎症和一般状态的影响:①一般状态:给药2周后,新痹痛灵各组大鼠进食状态、关节红肿、活动情况有不同程度改善;②关节炎指数:给药第28 d,与EAM组相比,新痹痛灵低、中剂量组大鼠关节炎指数评分明显降低(P<0.05),新痹痛灵高剂量组大鼠关节炎指数评分显著降低(P<0.01)。③足趾厚度:与EAM组相比,新痹痛灵低剂量组、甲氨蝶呤组给药第25天起右后足趾厚度明显降低(P<0.05);新痹痛灵中剂量组给药第19天起右后足趾厚度明显降低(P<0.05,0.01);新痹痛灵高剂量组给药第7天起右后足趾厚度明显降低(P<0.05,0.01)。④HE染色:与EAM组比较,各组大鼠炎细胞浸润较EAM组均有不同程度减轻。⑤Masson染色:与EAM组比较,各组大鼠胶原纤维的增生较EAM组均有不同程度减轻。4.新痹痛灵对EAM大鼠心肌TLR4、P38MAPK、NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA表达的影响:与正常对照组比较,EAM组心肌组织中的TLR4、TNF-α、IL-6 m RNA的表达升高(P<0.01),P38MAPK、NF-KB mRNA的表达无统计学意义;与EAM组相比,新痹痛灵高剂量组和甲氨蝶呤组能降低TLR4、TNF-α、IL-6 mRNA的表达(P<0.01)。5.新痹痛灵对EAM大鼠心肌总蛋白TLR4、My D88、P-P3 8MAPK、NF-KB/P-P65蛋白表达的影响:与正常对照组比较,EAM组大鼠心肌组织TLR4、My D88、NF-KB/P-P65、P-P38MAPK的蛋白表达是明显上调的(P<0.05),与EAM组相比,上述指标,新痹痛灵各剂量组和甲氨蝶呤组有不同程度降低(P<0.05)。提示新痹痛灵通过抑制TLR4/MAPK/NF-κB信号通路异常活化,是发挥其治疗作用的主要机制之一6.新痹痛灵对EAM大鼠心肌钙泵CaMKⅡ、PLB、P-PLB、SERCA2蛋白表达的影响:与正常对照组比较,EAM组SERCA2蛋白表达明显下调(P<0.05),CAMK Ⅱ、PLB及P-PLB蛋白表达上调(P<0.05)。与EAM组相比,新痹痛灵各剂量组和甲氨蝶呤组SERCA2蛋白表达明显上调(P<0.05);CAMK Ⅱ、P-PLB蛋白表达则明显下调(P<0.05);而新痹痛灵各剂量组PLB蛋白表达无统计学意义。提示新痹痛灵各剂量和甲氨蝶呤对EAM诱发的SERCA2a蛋白表达下调,CAMKⅡ及P-PLB蛋白表达上调有明显的抑制作用。7.新痹痛灵对EAM大鼠心肌核蛋白P-P38MAPK、NF-κB/P-P65、IRF3蛋白表达的影响:与正常对照组比较,EAM组大鼠心肌核蛋白P-P38MAPK、NF-κB/P-P65的蛋白表达是明显上调的(P<0.05),与EAM组相比,新痹痛灵各剂量组和甲氨蝶呤组P-P38MAPK、NF-κB/P-P65蛋白表达明显下调(P<0.05)。EAM组中IRF3蛋白表达较正常对照组无统计学意义,与EAM组相比,新痹痛灵各剂量组和甲氨蝶呤组IRF3蛋白表达无统计学意义。提示新痹痛灵可能主要通过抑制NF-κB信号通路的激活,来保护心肌。8.新痹痛灵对EAM大鼠滑膜组织中TLR4、NF-κB/P-P65、P-P3 8MAPK蛋白表达的影响:与正常对照组相比,EAM组滑膜组织TLR4、P-P38MAPK、NF-KB/P-P65蛋白表达明显上调(P<0.05)。与EAM组比较,新痹痛灵中剂量组TLR4蛋白表达明显下调(P<0.05);新痹痛灵各剂量组及甲氨蝶呤组NF-κB/P-P65蛋白表达明显下调(P<0.05);新痹痛灵高、低剂量组及甲氨蝶呤组P-P38MAPK蛋白表达明显下调(P<0.05)。提示新痹痛灵可能是通过抑制TLR4/MAPK/NF-κB通路的异常活化来减轻关节滑膜炎症。结论1.新痹痛灵组大鼠心肌炎症及损伤程度减轻,心功能得到改善。其作用机制之一,可能是通过抑制TLR4/MAPK/NF-KB信号通路的活化,减少IL-6、IL-17、TNF-α炎性因子的释放,从而产生了抗炎和免疫调节作用;其作用机制之二,可能是通过下调Caspase-3、Bax表达,上调Bcl-2表达,抑制心肌细胞凋亡;其作用机制之三,可能是纠正CaMK Ⅱ、SERCA2、PLB及P-PLB蛋白表达的异常,改善心肌细胞内Ca2+分布和运转障碍,恢复Ca2+介导的兴奋-收缩偶联过程。通过以上作用机制,共同起到改善心功能、减轻心肌炎症反应,抑制心肌损伤的作用,达到治疗EAM的效果,为类风湿关节炎心脏损害的免疫学机理探究以及进一步寻找中药干预类风湿关节炎并发心脏损害的作用靶点提供了潜在的新思路。2.对新痹痛灵低、中、高不同剂量组的疗效比较显示,随着剂量的增加,对TLR4/MAPK/NF-κB及CaMK Ⅱ信号通路的抑制作用及疗效均相应增强,说明新痹痛灵的疗效与药物剂量有一定相关性。3.新痹痛灵良好的减轻关节滑膜炎症作用很可能是通过抑制TLR4/MAPK/NF-κB通路的异常活化来实现的。