目的： 构建石英谐振式基因传感器阵列检测系统，以链延伸技术及肽核酸探针两种方法提高传感器阵列检测灵敏度，并探索对临床标本进行直接检测的可行性。 方法： 1．首先利用精细微加工法制作单个石英谐振式传感器，并在其两面光刻出金膜电极，比较了不同电极厚度及直径对基因杂交检测的影响。在此基础上先后构建了粘胶式2×5型传感器阵列以及夹具式2×5型传感器阵列。并自行开发研制自激式振荡电路、PESA V2.0版频率记录分析软件。将它们与计算机联用以构建石英谐振式基因传感器阵列检测系统。 2．分别用巯基固定法及生物素-亲和素固定法将人类乳头瘤病毒的探针固定在基因传感器阵列的金膜表面，并具体比较了两种方法的优劣。 3．基因传感器阵列表面分别固定上金黄色葡萄球菌mecA及femA两种探针片段，待杂交上相应的靶序列片段后，加入Klenow酶在室温下进行链延伸反应。 4．在传感器阵列表面固定上HBV的bis-PNA探针，并具体摸索了bis-PNA探针与HBV基因组DNA杂交时的最佳pH值、最佳离子浓度、最佳探针固定量、以及靶序列结合量对频率下降值的影响，并对靶序列量和对应频率下降值的关系进行了线性回归处理。实验后期还探索了利用bis-PNA探针对28例临床大三阳标本和12例阴性血清中抽提的基因组DNA直接进行检测的可行性，并与定量PCR法相比较，总结两种方法的 第三军医大学博士学位论文优劣并确定石英谐振式传感器检测临床血清标本 HBV DNA的检测限。结果： 1＊选择了更有利于传感器在液相中稳定的AT切型石英晶体作为传感器基片，金膜电极厚度在 50urn－100urn的范围内最适合于用作基因杂交的检测，电极直径一刀mm时插损较小、对质量负载承受能力强。在此基础上构建的粘胶式传感器阵列具有方便、快速、经济、节能等优点，但是对传感器在液相中振荡的稳定性影响较大。而夹具式传感器阵列克服了因粘胶的方式使传感器产生的应力分布随机性大的弊端，成功实现了传感器在液相中的稳定振荡。 1．2自行研制的自激式振荡电路有非常强的振荡能力，在液相中起振非常容易，其频率稳定度也可达实用要求。 1．3 自行开发的PESA VZ对版频率记录分析软件具有自行设置各初始参数，实时记录频率变化、自动绘制频率变化趋势图及分析结果等多项功能，采集、分析后的数据自动输入到计算机。 2．两种探针固定方法检测靶序列的灵敏度相当。生物素．亲和素法反应所需的时间较短，且具有放大效应，能结合上更多的探针并检测到更多的靶序列，但操作较为繁琐。流基法操作较为简单，但所需的反应时间较长。 3．基因传感器阵列在键延伸反应前的检测灵敏度为0．suM，但经链延伸反应后检测灵敏度提高到了0刀suM。 4．1随着杂交时缓冲液pH值从5．8升到8刀，杂交导致的频率下降值先高后低，以pH6．8为一个分水岭；而杂交平衡所用的时间在pH6．8之前总体上说相差尚不明显，但当pH值从6．8升到8对时，却骤然增加。 42离子浓度从 10mM增加至 100mM，对各组内杂交前后的频率下降值总的来看没有明显影响；但对杂交平衡时间的影响却至关重要。 4．3探针浓度从0刀05 p M到4刀p M变化时，其固定引起的频率变化值先升而后趋于平缓，而与HBV靶序列杂交所引起的频率变化值却是先升后降，以1．spM探针浓度为分界线；杂交平衡时间上各组间未见明显的变化趋势。 Vlll 链延伸及肽核酸石英谐振式基因传感器阵列检测系统的实验研究 4．4随着 HBV靶序列浓度从 10pg／L到 100 11 g／L变化时，杂交所引起的频率变化值先升后趋于缓和，以 10 u g／L靶序列浓度为分界线。在 lpg／L到 10 p g／L 的靶序列浓度范围内，与频率下降值的线性回归方程为l＋C＝－2．7455＋0＊691X 凸F。平关系数 r＝0二9923。而杂交平衡时间上却未见明显的变化趋势。 4．5在对28例临床大三阳标本血清中抽提的基因组DNA的检测过程中，26例标本检测结果为阳性，阳性率为92．86％，频率下降范围在11＊｝刀＊z之间，所用时间为38加n至用加n不等。而定量P＊R法检测28例均为阳性。12例阴性血清抽提的DNA样本两种方法检测均为阴性。通过定量 PCR的检测换算出传感器检测限为每毫升血清 2．43 X 10’拷贝，即8石pg／L。且两种方法经统计学分析没有显著性差异。结论： 1．夹具式2X5型传感器阵列在液相中振荡时稳定性更高。 2．自激式振荡电路对石英谐振式基因传感器阵列的液相振荡进行了特别的优化，使传感器阵列能够在液相中更稳定地工作。 3．“ PESA VZ刀”应用软件是一类可实时记录与分析石英晶体谐振频率的新型实用性软件。 4．将上述组件组合在一起所构建出的第三代检测系统为后续实验搭建了一个坚实的技术平台，相信也可以为临床上病原性微生物的检测以及多种疾病的早期诊断提供一种与常规的检测方法完全不同?