水稻植株吸收镉离子经根部质外体、共质体途径进入维管束系统,通过木质部、韧皮部运输,最终到达籽粒。在运输过程中,镉结合转运蛋白质起到了关键调节与运输作用,通过调节其表达量是降低水稻籽粒镉含量,控制镉对人类危害的可行性途径。然而仅若干转运蛋白得到鉴定,且功能不明确。目前,鸟枪法蛋白质组学技术为镉结合蛋白质的研究提供了新的探索途径,但在处理蛋白质组时,去垢剂的除杂是其面临的技术难题,且基于固定化螯合金属柱富集水稻镉结合蛋白质的方法欠缺。本文针对鸟枪法蛋白质组学去垢剂除杂、镉结合蛋白质富集方法及其种类鉴定进行初步研究,旨在建立一种适合水稻蛋白质组去除去垢剂以及镉结合蛋白质富集方法,从而利用建立的方法对水稻镉结合蛋白质种类进行初步探索。本实验主要研究结果如下:1、建立了基于新型亲和去垢小柱去除SDS的方法,为水稻镉结合蛋白质的研究提够了必要的技术支撑。实验通过系统性的比较FASP法、亲和去垢小柱法和丙酮沉淀法对SDS去除效率及对蛋白鉴定结果的影响,表明亲和去垢小柱法极大地简化了蛋白样品制备的步骤,提高了结果的可靠性,实现了高通量分析。2、建立了基于Hitrap Chelating HP小柱富集水稻植株中镉结合蛋白质方法。实验通过优化咪唑洗脱浓度、p H、盐离子浓度以及最终质谱上机浓度,确定了60 mmol/L咪唑作为蛋白质洗脱浓度,在不同浓度咪唑洗脱Cd-Hitrap柱,选择40、60 mmol/L作为中低浓度,300 mmol/L作为高浓度洗脱,洗脱液p H为5.8,Na Cl浓度为500 mmol/L,溶解体积为100μL。3、利用所建立样品前处理的方法,采用Nano LC-LTQ-Orbitrap/Ms对蛋白质进行鉴定。采用含60mmol/L咪唑缓冲液洗脱Cd-Hitrap柱,中-67、中-55、晚-78以及L-18叶片依次鉴定到蛋白质数目为176、253、129和109,鉴定到根部蛋白质数目为139、134、136和135。叶片排名前5位的蛋白质功能为核苷酸结合活性(14%)、酶活性(12%)、ADP/ATP结合活性(9%)、DNA结合活性(8%)和金属离子结合活性(7%),根部为酶活性(21%)、ADP/ATP结合活性(16%)、金属离子结合活性(11%)、核苷酸结合活性(9%)和结构分子活性(5%)。叶片前5位蛋白质生物学过程为转运过程、细胞组成和生物合成、代谢过程、调控生物学过程和细胞分裂,根部为细胞组成和生物合成、调控生物学过程、代谢过程、刺激反应和细胞信号过程;叶片中排名前5位亚细胞位置为细胞质、细胞膜、细胞核、细胞骨架和叶绿体,根部为细胞质、细胞骨架、细胞核、细胞膜和染色质。鉴定蛋白质依赖数据库和不依赖数据库、错配率(FDR)与匹配肽段数、诱导离子和目标离子进行了分析,表明实验数据可靠。4、研究了鉴定蛋白质镉结合强弱及其专一性。结果表明:在水稻叶片中:在一定程度上仅能结合Cd2+蛋白质为15个;结合Cd2+、Zn2+有5个;结合Cd2+、Cu2+1个;三种金属离子均结合有11个。水稻根中:在一定程度上仅结合Cd2+为8个;结合Cd2+、Zn2+为4个;结合Cd2+、Cu2+为3个;结合三种金属离子为7个。