黄芪总黄酮(total flavonoids of Astragalus, TFA)是从传统中药黄芪中分离出的黄酮类成分,具有广泛的生物活性。实验室前期研究表明TFA具有显著的体内外抗炎和免疫增强等作用,并证实与调控MAPK信号途径相关。但对NF-κB信号通路的影响尚未研究和报道,对其调控机制有待于进一步探索。本研究以RAW264.7细胞为试验对象,研究TFA对正常培养条件下和LPS刺激的RAW264.7细胞中炎症因子基因转录水平的影响,并通过检测NF-κB信号通路中关键蛋白的表达,深入探讨TFA的抗炎免疫调控机制,为TFA的研发应用提供科学依据。首先用MTT法确定TFA的安全试验剂量,试验结果显示,0-150 (μg/mL TFA无明显的细胞毒性作用(P>0.05),所以拟定TFA 10 μg/mL、5 μg/mL,100μg/mL为TFA低、中、高剂量组。进一步采用RT-PCR法检测两种条件下,TFA对细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α及IL-10mRNA转录水平的影响,以及Western-blot法测定两种条件下,TFA对NF-κB信号转导通路关键蛋白IKKa/β及p-IKKα/β、IκBα及p-IκBα, C-NF-κB p65及N-NF-κB p65蛋白表达的影响,探讨TFA抗炎免疫调控机制。RT-PCR结果显示,黄芪总黄酮能够剂量依赖性的上调正常培养条件RAW264.7细胞IL-1β、IL-6、TNF-α及IL-10 mRNA转录水平(P<0.05或P<0.01)；黄芪总黄酮能够剂量依赖性的抑制LPS刺激的RAW264.7细胞IL-1β、 IL-6、TNF-α mRNA的过度表达,上调IL-10 mRNA转录水平(P<0.05或P<0.01)。结果表明,黄芪总黄酮可以在转录水平上调控细胞因子mRNA表达,进而调控机体免疫效应。Western-Blot结果显示,黄芪总黄酮能够剂量依赖性的下调正常培养条件RAW264.7细胞中IKKα/β、IκBα、C-NF-κB p65蛋白的表达,适度上调p-IKKα/β, p-IκBα、N-NF-κB p65蛋白的表达(P<0.05或P<0.01)；黄芪总黄酮能够剂量依赖性的上调LPS刺激的RAW264.7细胞中IKKa/β、IκBα、 C-NF-κB p65蛋白的表达,下调p-IKKα/β、p-IκBα、N-NF-κB p65蛋白的过度表达(P<0.05或P<0.01)。结果表明,黄芪总黄酮能够调控NF-κB信号通路中IKKα/β、IκBα的磷酸化和NF-κB p65从胞浆解离向核中移位,从而发挥抗炎免疫作用。综上试验结果表明,黄芪总黄酮通过调控NF-κB信号转导通路中关键因子IKKα/β及p-IKKα/β、IκBα及p-IκBα、C-NF-κBp65及N-NF-κB p65蛋白表达,活化或抑制NF-κB信号通路,调控细胞因子mRNA表达,从而发挥其抗炎免疫调节作用。