论文部分内容阅读
犬细小病毒病(Canine Parvovirus disease)是由犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)引起犬的一种急性传染病。本病在世界各地均有发生，各种年龄、品种的犬易感，尤其是断奶后幼犬的发病率和死亡率均很高。随着养犬业的发展，对犬病的防控日趋重要。因此，制定积极有效的预防措施，获得及时准确的诊断信息至关重要。本试验通过设计合成特异性引物，扩增CPV VP2基因并进行了原核表达，纯化后获得VP2重组蛋白，以其为包被抗原建立敏感、特异、检出率高的间接ELISA方法；同时用此方法对抗CPV特异性单抗进行筛选，以获得了抗CPV VP2特异性单抗。根据GenBank公布的CPV VP2基因序列，设计并合成一对特异性引物，以CPV-YM株为模板经经PCR扩增出VP2基因片断，将其克隆到pMD18-T载体中。经过测序后，将VP2基因亚克隆至原核表达载体pET-30a上，然后转入表达宿主菌Rosetta中，表达了目的蛋白，表达量为29％，分子量约为67ku。通过Western blot证明该重组蛋白具有抗原性。VP2重组蛋白经镍离子亲和树脂纯化，纯度达到0.7mg／mL。用VP2重组蛋白作为包被抗原，确定了最佳优化条件和结果判定标准。通过特异性试验证明包被的抗原仅与CPV标准阳性血清发生反应，不与犬瘟热、犬腺病毒、犬副粘病毒、波特氏杆菌等疫病的标准阳性血清发生交叉反应；与进口CPV ELlSA试剂盒进行比对，对血清样品92份的检测结果表明符合率为97.8％；对相同的血清样品48份进行了4次重复试验变异系数小于16％。因此本试验成功的建立了检测CPV血清抗体的间接ELISA方法。应用该方法对国内部分地区采集的血清样品227份进行检测，其中164份为阳性，阳性率为72.25％。以纯化的CPV-Z株免疫BALB／c小鼠，应用杂交瘤技术，采用已建立的间接ELISA方法筛选获得了能稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系3株，分别命名为E4F11F7，E389C4，F10G10A10。亚类鉴定结果表明E4F11F7为IgG2a，其它为IgM；轻链均为k型。Western blot结果表明均与VP2重组蛋白和CPV发生反应，证明这些单抗具有良好的特异性。