新城疫(Newcastle disease, ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)强毒引起的一种烈性传染病,对全球养禽业造成严重的经济损失。NDV属于副粘病毒科、副粘病毒亚科的禽腮腺炎病毒属,是一种单股、负链有囊膜的RNA病毒。其基因组长度约为15.2Kb,基因组结构模式为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’依次编码6种蛋白：核衣壳蛋白(Nucleocapsid Protein, NP)、磷蛋白(Phosphate Protein, P)、基质蛋白(Matrix Protein,M)、融合蛋白(Fusion Protein, F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(Hemagglutinin-Neuraminidase Protein, HN)和大分子蛋白(Large Polymerase Protein, L)。自上世纪90年代早期出现以来,基因Vlld亚型NDV已经成为我国优势流行基因型。研究表明,基因VIld亚型新城疫病毒HN基因E347K变异会增大其与疫苗株的抗原性差异,但这种变异株的流行情况尚不清楚。此外,目前缺乏对活禽市场鸡群中弱毒NDV流行情况的数据。为此我们对2008-2013年华东地区新城疫病毒进行分子流行病学研究,以进一步阐明华东地区强毒NDV的流行情况,以及活禽市场中弱毒NDV的流行情况。同时,选取自1997-2013年分离自江苏地区的基因Vlld亚型NDV进行全基因组序列分析,以阐明本地区基因Vlld亚型NDV的进化动力学。我们还对HN基因在疫苗的保护性中的作用及HN基因E347K变异对病毒抗原性的影响进行研究,发现疫苗株与攻击强毒抗原性匹配程度对疫苗保护作用有很大影响,而HN基因E347K变异是产生抗原性差异的重要原因。1.2008-2013年华东地区新城疫病毒分子流行病学研究本研究对2008-2013年从华东地区分离的新城疫病毒进行遗传进化分析。从临床病料中共分离到75株NDV,这些NDV具有不同的宿主来源,主要来自鸭源、鹅源和鸡源；从华东地区活禽市场中共分离到247份ND阳性样品,分离率为3.48%,其中class I阳性样品为236份,阳性率为3.32%,获得class I NDV34株,class II日性样品经鉴定均为疫苗株LaSota或者V4。2008-2010年在华东地区临床样品中未检测到强毒NDV,2011-2013年分离到55株基因Vlld亚型NDV,这55株基因Vlld亚型NDV可以进一步分为Ⅶd1(3/55)和Ⅶd2(52/55)亚型两个分支,3株基因Ⅶd1亚型分离株均为2011年分离,2012-2013年分离株均属于Ⅶd2亚型。39/55株基因Vlld亚型NDV分离株的F基因发生K78R变异。对HN基因线性表位及其周围的氨基酸位点进行分析发现,38/55株基因Ⅶd亚型NDV发生E347K变异,并同时发生G362A变异。此外,疫苗保护试验结果表明,LaSota株并不能有效降低排毒率及排毒量。在活禽市场共分离34株class I新城疫病毒,21株为鸡源,13株为水禽源,分离株中除了CK/JS/03/09和CK/JS/02/10两株病毒外,其余的2008-2010分离的毒株均与D/ZJ/26/05和D/JS/1/07处于同一个小分支,属于3b亚型,其余均为3c亚型。我们监测结果表明,华东地区基因Vlld亚型NDVHN基因E347K变异株已成为流行优势：活禽市场class I毒株出现新的3c亚型,而且已经发生由水生禽类向陆生禽类的跨种间传播,因此有必要对其进行持续监测。2.江苏地区基因Ⅶd亚型新城疫病毒进化动力学研究本研究对从1997-2013年从江苏地区分离的25株基因Ⅶd亚型NDV进行全基因组序列分析。根据6个基因及全基因组核苷酸序列绘制的遗传进化发生树高度一致,分为Ⅶd1和Ⅶd2两个亚型。通过比对分析发现,NP基因有3个位点存在差异,其中2011。2013年分离株与之前的分离株相比发生T2201变异；P基因有5个位点发生变异,其中2011-2013年分离株与之前的分离株相比发生G320E和R380K变异；M基因有6个位点发生变化；F基因有5个位点发生变化,其中2011-2013年分离株与之前的分离株相比发生K78R变异；HN基因有6个位点发生变化,其中2011-2013年分离株与之前的分离株相比发生E347K和G362A变异；L基因有8个位点发生变化。使用贝叶斯估算方法对6个基因进行进化速率分析,统计结果显示基因Ⅶd亚型NDV的6个基因的进化速率分别是：NP基因为1.18×10-3；P基因为8.47×10-4；M基因为1.00×10-3：F基因为1.25×10-3；HN基因为1.24×10-3；L基因为1.16×10-3核苷酸替代／位点/年。进化率计算结果显示江苏地区基因Ⅶd亚型NDV的平均进化速率为1.06x 10-3核苷酸替代／位点／年(9.03×1-4～1.25×10-3替代／位点／年),基于拼接的基因组序列BSP分析方法推测基因Ⅶd亚型NDV最早应该出现在1991年左右。总之,本研究基因对Ⅶd亚型NDV的进化规律进行了揭示。3.HN基因变异对疫苗保护性的影响新城疫疫苗免疫目前是防控NDV的一种重要途径。F和HN是NDV的两个表面囊膜糖蛋白,均对病毒的抗原性存在显著影响。目前,大量研究表明F糖蛋白对疫苗的保护性起主要作用。本研究通过反向遗传技术,对HN基因在疫苗保护性中的作用进行研宄。本研究通过在基因Ⅶd亚型疫苗候选株A14骨架上替换流行株JS-16-12-Ch的HN基因,构建并拯救新候选疫苗株O/A14,比较A14、O/A14及LaSota株三者用流行株攻击时保护力差异。将三个疫苗株与JS-16-12-Ch进行交叉中和及交叉血凝抑制试验,结果表明A14株和LaSota株与JS-16-12-Ch株存在显著抗原性差异,而O/A14株与JS-16-12-Ch的抗原性差异不显著。攻毒保护试验结果表明,O/A14免疫组喉头及泄殖腔排毒率显著低于A14及LaSota免疫组。攻毒后3天喉头棉拭病毒定量结果表明,O/A14免疫组显著低于A14及LaSota免疫组。对攻毒后3天部分脏器进行病理学观察及病毒定量,病理学观察发现,O/A14免疫组及A14免疫组病变程度相似,均轻于LaSota免疫组,而O/A14免疫组胸腺、肾脏和肺的病毒载量显著低于A14及LaSota免疫组。我们的研究结果表明,疫苗株的HN基因对疫苗的保护性具有重要的作用,其与流行株的抗原性匹配程度决定了免疫禽群的排毒率及排毒量。4.HN基因E347K及G362A变异对病毒抗原性影响的研究流行病学监测结果表明基因Ⅶd亚型NDV HN基因E347K变异株在华东地区已经成为优势流行株。同时,研究表明HN基因通过某些位点的改变,对病毒抗原性造成显著影响,进而对疫苗的保护性造成影响。本研究在基因Ⅶd亚型新城疫病毒JS-5-05-Go (14)骨架上对其HN基因进行E347K单点突变拯救点突变病毒347/14株,G362A单点突变拯救点突变病毒362/14株以及E347K、G362A双点突变拯救点突变病毒347+362/14株。通过交叉血清学试验,对突变后的病毒与母本病毒的抗原性差异进行评价,初步说明这两个位点对病毒抗原性的影响。我们将14株的HN基因表达至鸡痘病毒<FPV)中,构架重组鸡痘病毒rFPV-HN,纯化后免疫SPF鸡,分别用三个点突变病毒及母本病毒攻毒,对排毒率、排毒量及病理学变化进行比较,进一步阐释E347K和G362A变异对病毒抗原性的影响。交叉中和试验结果表明两个347/14及347+362/14株与母本病毒14株的中和试验R值均为0.38,而362/14株与14株的中和试验R值为0.65,说明347/14及347+362/14株与母本病毒14株存在显著抗原性差异,而362/14株则存在较小的抗原性差异。动物试验结果表明,347/14、362/14及347+362/14攻毒组泄殖腔排毒率均显著高于14攻毒组,对攻毒后3天喉头排毒进行病毒定量,结果表明,347/14、347+362/14攻毒组排毒量显著高于14攻毒组,而362/14与14及347/14与347+362/14攻毒组不存在显著性差异。组织病理学观察表明,34736/142组的组织病变重于347/14组,而362/14组及14组的病变最轻。同时,对部分组织脏器的病毒定量结果与喉头棉拭定量结果相一致,347+362/14组和347/14组组织病毒载量均显著高于未突变的14组,而362/14组仅在法氏囊与14株存在显著性差异,347+362/14组和347/14组不存在显著差异。我们的研究结果表明,HN基因E347K变异会对病毒抗原性造成显著性影响,而G362A变异对病毒抗原性影响较为有限,而E347K及G362A双突变对病毒抗原性影响存在部分协同作用,会进一步增大抗原性差异,但并未显著高于E347K变异。