由于患者自身患有心脑血管疾病、手术因素和麻醉因素,造成围手术期脑、脊髓缺血再灌注损伤的病例并不少见,而且一旦发生,后果极为严重。比如脑血管畸形手术脑缺血再灌注损伤的发生率高达42.9%,围手术期脑中风一旦发生,死亡率高达33-60%。胸腹主动脉瘤手术因阻闭主动脉造成脊髓缺血再灌注损伤,术后截瘫的发生率高达10%以上。因此如何有效的预防和治疗围手术期脑、脊髓缺血再灌注损伤是临床亟待解决的一个关键问题。不同于普通的“脑中风”或因意外造成的脊髓损伤,围手术期的脑、脊髓缺血再灌注损伤具有一定的可预见性。因此,采取早期干预措施预防和治疗围术期脑、脊髓损伤,不仅可行而且意义重大。吸入麻醉剂作为临床应用最为广泛的麻醉剂其神经保护作用已越来越受到研究者的关注。本实验室前期研究证明缺血前给予吸入麻醉剂七氟醚预处理可以明显减轻缺血-再灌注后脊髓神经元损伤,改善动物神经行为学,但是其神经保护作用的具体机制并不清楚。双孔钾通道是近年发现的一类新的钾通道亚型,其中TREK-1高表达于哺乳动物的中枢神经系统。新近的研究发现TREK-1通道的开放与神经保护之间存在密切联系。然而TERK-1分子是否参与吸入性麻醉剂预处理诱导的神经保护作用有待明确。本研究第一部分旨在探讨TREK-1在七氟醚预处理诱导的脑保护中扮演了什么角色,以其阐明七氟醚预处理的关键机制,为其临床运用提供新的科学依据。在致力于寻找合适的预处理药物和方案进行预防的同时,我们同样关注脑、脊髓损伤后的早期治疗,因为早期治疗较之康复治疗对于改善患者预后具有更重要的意义。早期氢气治疗近年来在多类器官损伤中表现出一定疗效,包括急性的肾脏、心脏、肝脏的缺血再灌注损伤,肺脏的炎症损伤,以及脓毒血症的治疗等方面。一些研究证实,富含氢的盐水或水可减轻创伤性脊髓损伤。此外,我们先期的研究结果显示,吸入氢气可明显提高脓毒症小鼠的生存率,减少多器官损伤。这些结果都提示我们,早期氢气治疗很可能对于脊髓缺血再灌注损伤有效。本研究第二部分主要探讨氢气在缺血性脊髓损伤早期治疗中的作用及其相关机制。第一部分TREK-1在七氟醚预处理诱导的脑缺血耐受中的作用机制研究实验一七氟醚预处理对局灶性脑缺血-再灌注后TREK-1表达的影响目的探讨七氟醚预处理诱导脑缺血耐受时TREK-1表达的改变。方法采用大脑中动脉阻闭(MCAO)的方法,制作大鼠局灶性脑缺血-再灌注模型。雄性Sprague-Dawley大鼠24只,随机分为3组(n=8):①预处理缺血组,大鼠接受2.7%七氟醚与97%氧气混合吸入预处理45 min,60 min后行MCAO90 min;②单纯缺血对照组,大鼠接受97%氧气吸入45 min,60 min后行MCAO90 min;③假手术组,大鼠接受2.7%七氟醚与97%氧气混合吸入预处理45 min,但不行MCAO模型。分别于再灌注24、48、72h行神经功能评分(NBS),末次评分后取脑行TTC染色并分析脑梗死容积结果。同时,另一部分动物分为相同三组(n=12),分别于再灌注4、24、72h取材进行Western-blot及Real-time PCR实验,观察脑部TREK-1在不同时间点表达变化情况。结果(1)TTC结果分析:七氟醚预处理组再灌注72h后梗死容积小于单纯缺血对照组(P<0.05)。(2)神经功能评分:假手术组动物无运动神经功能改变,预处理缺血组动物评分均高于同一时间点单纯缺血对照组(P<0.05)。(3)蛋白含量:预处理缺血组动物TREK-1蛋白表达量高于同一时间点单纯缺血对照组(P<0.05)。(4)mRNA:预处理缺血组动物TREK-1 mRNA转录水平高于同一时间点单纯缺血对照组(P<0.05)。结论七氟醚预处理后行局灶性脑缺血再灌损伤,脑组织中TREK-1较单纯缺血组在转录和蛋白表达水平均明显增高。实验二下调细胞TREK-1表达对七氟醚预处理诱导神经保护作用的影响目的在七氟醚预处理的体外培养细胞氧糖剥夺模型抑制TREK-1蛋白表达,明确TREK-1蛋白表达在七氟醚预处理的神经保护中的作用。方法( 1)人神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y)诱导分化鉴定:根据不同时间诱导分化后细胞的神经元特异性核蛋白NeuN和神经元骨架蛋白βⅢ-Tublin表达结果,确定细胞诱导分化为类神经元的最佳时间。(2)细胞siRNA干扰与鉴定:向类神经元细胞加入TREK-1小RNA干扰成品后测定TREK-1表达。(3)siRNA干扰对预处理效应的影响:①对照组:细胞未经siRNA干扰、七氟醚预处理和氧糖剥夺;②预处理+小RNA干扰+氧糖剥夺组:细胞经siRNA干扰,24h后2.4%七氟醚预处理2h,24h后进行氧糖剥夺2h;③预处理+氧糖剥夺组:细胞未经siRNA干扰, 2.4%七氟醚预处理2h;④对照组+小RNA干扰+氧糖剥夺组:细胞经siRNA干扰,24h后对照空气处理2h,24h后进行氧糖剥夺2h;⑤对照组+氧糖剥夺组:细胞未经siRNA干扰,对照空气处理2h,24h后进行氧糖剥夺2h。所有细胞均于末次处理后24h行细胞爬片和蛋白提取。结果(1)诱导分化鉴定:Western-blot和免疫荧光结果均显示神经元特异性核蛋白NeuN以及神经元骨架蛋白βⅢ-Tublin诱导分化7天组表达最强(P<0.05),因此确定诱导分化的时间为7天。(2)siRNA干扰与鉴定: Western-blot结果显示小RNA抑制组TREK-1表达明显减低,与溶剂对照组和乱序对照组相比有统计学差异(P<0.05)。(3) siRNA干扰对预处理效应的影响:Western-Blot和免疫荧光结果均显示:预处理+小RNA干扰+氧糖剥夺组凋亡蛋白Capase-3的表达量明显升高,与对照组+氧糖剥夺组相比无统计学差异,与预处理+氧糖剥夺组比较有统计学差异(P<0.05);MTT结果显示预处理+小RNA干扰+氧糖剥夺组细胞OD值较预处理+氧糖剥夺组明显降低,细胞死亡增加,与对照组+氧糖剥夺组无统计学差异。结论细胞水平证实抑制TREK-1蛋白表达逆转了七氟醚预处理的神经保护作用,说明TREK-1介导了七氟醚预处理诱导的神经保护作用。实验三下调大鼠脑TREK-1表达对七氟醚预处理诱导脑缺血耐受的影响目的研究在体抑制TREK-1蛋白表达后,七氟醚预处理诱导的脑缺血耐受有无改变。方法(1)活体siRNA干扰与鉴定:大鼠进行单次siRNA侧脑室注射,24h后取材,与对照组比较TREK-1表达情况;(2)siRNA干扰对缺血耐受性的影响:雄性SD大鼠90只,随机分为5组(n=18):①假手术组,大鼠仅行分离而不阻闭血管;②对照组,大鼠接受97%氧气吸入45 min;③预处理+MCAO组,大鼠接受2.7%七氟醚与97%氧气混合吸入预处理45 min;④小RNA干扰+预处理+MCAO组,大鼠进行单次siRNA侧脑室注射,24h后大鼠接受2.7%七氟醚与97%氧气混合吸入预处理45 min;⑤小RNA干扰乱序对照+预处理+MCAO组,大鼠进行单次siRNA乱序对照侧脑室注射,24h后大鼠接受2.7%七氟醚与97%氧气混合吸入预处理45 min。后四组均于处理后60 min行MCAO 90 min。每组动物分别于缺血-再灌注24、48、72h进行双盲神经行为学评分,并在72h评分结束后取脑进行TTC染色,观察脑梗死容积情况。结果(1)神经功能评分(NBS):再灌注24、48、72h小RNA干扰预处理+MCAO组动物NBS低于预处理+MCAO组(P<0.05),与对照组相同时间点相比无统计学差异。(2)TTC结果分析:再灌注72h小RNA干扰+预处理+MCAO组动物脑梗死容积大于预处理+MCAO组(P<0.05)。结论下调大鼠脑组织TREK-1表达后,七氟醚预处理诱导的脑缺血耐受作用消失,表明TERK-1蛋白表达上调是七氟醚预处理诱导脑缺血耐受的重要机制。第二部分氢气治疗脊髓缺血再灌注损伤的作用及机制研究实验一围术期早期氢气治疗在兔脊髓缺血再灌注损伤中的作用目的探讨早期氢气治疗在脊髓缺血再灌注损伤中的保护作用。方法浓度为1%,2%,4%的氢气与麻醉气体混合吸入,共同给予麻醉动物,治疗时间为脊髓缺血再灌注前10 min及再灌注60 min,总计70 min。用仪器实时监控H2浓度,使其达到预期浓度。围术期(包括缺血前10 min到再灌注60 min)监测动脉血气、血糖。再灌注24、48及72h对动物进行后肢运动功能评估。在最后一次运动功能评估后,取L3-4节段,进行组织HE染色,并进行病理学检查,计数前角剩余正常运动神经元数量,进行统计分析。结果各组间生理学参数,包括动脉血压、血气和血糖无统计学差异。对照组完全瘫痪,2%和4%氢气吸入组,运动神经评分明显高于对照组(P<0.05),1%氢气治疗组与对照组相比较,没有统计学差异,4%组与2%组间没有统计学差异。在2%和4%H2组,前角正常神经元数目明显多于对照组(P<0.05),两组之间无统计学差异;而1%H2组,前角剩余正常运动神经元数目与对照组相比没有统计学差异。结论2%和4%氢气吸入能明显改善脊髓缺血再灌注损伤后动物运动神经功能,过低浓度(1%)氢气吸入则无改善, 4%与2%浓度组相比,并没有使运动神经功能得到进一步改善。实验二氢气吸入治疗对兔脊髓缺血再灌注损伤炎症反应和氧化应激的影响目的炎症和氧化应激是脊髓缺血再灌注损伤的关键机制,本部分实验主要研究氢气吸入能否调节脊髓缺血后的炎症及氧化应激反应。方法根据实验一结果,本部分采用2%氢气吸入作为治疗方案,进一步进行机制研究。18只动物随机分为3组(n=6):假手术组(sham)、对照组、2%氢气治疗组。sham组不接受缺血,对照组和治疗组接受缺血,方案同实验一。再灌注6、8、12、24、48及72h,检测血清及缺血脊髓节段8-iso-PGF2α、MDA、SOD、CAT、TNF-α及HMGB1水平,结果进行统计分析,并在再灌注72h后,进行TUNEL染色及caspase-3激酶活性检测。结果(1)在各时间点,H2治疗组血清及缺血脊髓节段MDA和8-iso-PGF2α含量均低于缺血对照组(P<0.05);(2)对照组血清和脊髓内SOD和CAT的活性低于Sham组(P<0.05),H2治疗组SOD和CAT活性明显高于缺血对照组(P<0.05);(3)对照组血清和脊髓内TNF-α和HMGB1明显高于假手术组(P<0.05),而H2治疗组在各时间点明显低于对照组水平;(4)TUNEL阳性神经元和caspase-3活性在H2治疗组少于或低于对照组(P<0.05)。结论早期氢气治疗能够抑制氧化应激及炎症反应,这可能是其治疗脊髓缺血损伤的关键机制。小结1.七氟醚预处理后脑组织中的TREK-1在转录和蛋白表达水平较单纯缺血组均明显增高。2.细胞水平证实抑制TREK-1蛋白表达逆转了七氟醚预处理的神经保护作用,说明TREK-1介导了七氟醚预处理诱导的神经保护作用。3.在体实验证实TERK-1蛋白表达上调是七氟醚预处理诱导脑缺血耐受的重要机制。4.早期吸入氢气治疗能够减轻脊髓缺血再灌注损伤,2%氢气吸入可以取得满意的疗效。5.氢气治疗脊髓缺血再灌注损伤的的保护机制与保持抗氧化物酶活性以及抑制继发性炎症反应有关。