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奶牛的奶产量主要取决于乳合成能力和牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)增殖的能力,而乳脂肪是评估牛奶质量的重要指标。在生命科学领域,探究乳脂肪合成的分子机制是一个重要的科学问题。脂肪酸(fatty acids,FAs)既是提供能量的物质,也是生物膜组成的一部分,而且还能经转录因子活化和细胞膜受体信号的途径从而调控基因的表达。脂肪酸可以通过刺激脂肪生成基因的表达来促进乳腺中乳脂的合成。棕榈酸(palm acid,PA)是脂肪合成的主要底物之一,因此可以推测在乳脂肪合成过程中,棕榈酸既可作为乳脂前体物,也可作为影响乳脂肪合成的信号分子。作为外源信号,棕榈酸可以通过激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)来调控细胞代谢。实验室前期研究结果表明,PA参与调节BMECs乳脂合成,但具体机制有待进一步探索。G蛋白偶联受体C家族6组A(G protein-coupled receptor class C group 6 member A,GPRC6A)是近年来新发现的一种G蛋白偶联受体,可与多种配体结合,已有研究发现,GPRC6A参与BMECs乳合成,但具体机制有待进一步探索。本实验的研究对象为通过组织块法培养的BMECs,通过免疫荧光和Western blotting观察BMECs中角蛋白18(cytokeratin 18,CK18)的表达,从而证明已获得纯化并且生长状态良好的可进行体外培养的BMECs。向在体外进行培养的BMECs中添加0、50、100、150和200μM的PA,通过BODIPY染色以及甘油三酯(triglyceride,TG)试剂盒进行检测,结果表明随着PA浓度的增加,BMECs中脂滴及TG含量逐渐增加;通过Western blotting的方法检测相关蛋白的表达,在PA浓度为100μM时,对乳脂合成以及固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP-1c)的表达和成熟具有最佳刺激作用,同时p-PKCα的蛋白水平也显著增加,随后下降。以上结果说明PA通过剂量依赖性的方式促进乳脂合成;添加100μM的PA为最适浓度,过量的PA可能具有细胞毒性。为研究PA调节SREBP-1c表达和成熟的分子机理,添加PA同时添加PI3K抑制剂LY294002抑制PI3K信号通路。Western blotting检测发现,抑制PI3K几乎完全阻断了PA对SREBP-1c表达的刺激。PI3K抑制实验表明,PI3K是PA诱导SREBP-1c表达的关键介导分子。添加100μM的PA同时抑制蛋白激酶Cα(PKCα),通过Western blotting检测表明,PKCα敲低仅部分降低了PA对SREBP-1c表达的刺激,但消除了PA对SREBP-1c成熟的刺激作用,同时部分降低了PA对PI3K激活的刺激。PKCα抑制实验表明,PKCα和PI3K可能具有不同的信号调节机理。添加100μM的PA同时抑制GPR120和GPRC6A,通过Western blotting检测表明,PA不影响GPR120的表达,并且敲低GPR120不会改变PA对SREBP-1c信号的刺激。GPRC6A基因敲低显著降低了PI3K和PKCα的磷酸化以及SREBP-1c的表达和成熟。GPRC6A抑制实验表明,GPRC6A是PA对PI3K/PKCα-SREBP-1c信号传导刺激的关键介导分子。Western blotting检测发现,添加100μM PA后,BMECs中GPRC6A的蛋白质水平显著增加。免疫荧光检测发现GPRC6A荧光信号形成一个薄而圆形的结构,表明GPRC6A位于BMECs的质膜上。免疫荧光检测发现100μM的PA处理显著增加GPRC6A的细胞膜定位。结果证明PA以剂量依赖的方式促进GPRC6A表达和质膜定位,提示PA可能是GPRC6A的一种新的激活因子。以上结果表明,PA剂量依赖性调节GPRC6A表达定位、PKCα活化和SREBP-1c蛋白表达及成熟,过量的PA可能具有细胞毒性。PA通过GPRC6A-PI3K/PKCα信号传导途径促进BMECs的乳脂合成。本研究工作为进一步利用PA提高乳脂肪合成提供了理论与实验依据。