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小花棘豆Alternaria oxytropis内生真菌可合成苦马豆(Swainsonine,SW),SW是一种有毒的吲哚里西啶生物碱,牲畜过量采食含SW的小花棘豆会中毒,给畜牧业带来严重的损失。真菌中SW合成代谢途径尚未清晰,酵母氨酸还原酶是该途径的关键酶之一,Alternaria oxytropis内生真菌酵母氨酸还原酶基因(sac)在SW合成代谢途径中起重要作用。课题组前期体外培养出小花棘豆野生型内生真菌OW7.8,获得了基因缺失突变株M1,并构建了该基因功能互补载体(pBARGPE-Sac)。本研究以小花棘豆Alternaria oxytropis内生真菌野生株OW7.8和酵母氨酸还原酶基因缺失突变株M1为研究对象,在液体培养基中培养内生真菌,提取菌丝及发酵液中的SW,利用高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)检测SW含量;探索了不同培养时间下实验组(添加酵母氨酸)和对照组(不添加)中SW合成动态变化,进行统计学分析;验证sac互补载体后,将其转化至M1的原生质体,经再生和抗性筛选得到sac基因功能互补株,利用PCR技术检测其sac,用反转录PCR(RT-PCR)检测sac和潮霉素磷酸转移酶基因(hph)的表达情况,用HPLC-MS法检测其SW含量,并与OW7.8和M1进行了对比分析。主要结果如下:1.液体培养时菌丝的SW含量高于发酵液中SW含量,菌丝中SW含量为5.500μg/mg,而发酵液中SW含量仅0.089μg/ml。SW存在于细胞内。2.利用HPLC-MS技术测定内生真菌中SW含量,SW含量均呈现先上升后下降趋势;对照组中,OW7.8中SW含量普遍高于M1,OW7.8的SW含量在第29 d时最高,M1在第23 d时最高;在实验组,OW7.8的SW含量在第26 d最高,M1的在第20 d最高。经统计学分析表明:对OW7.8而言,实验组与对照组的SW含量无显著差异;对M1而言,实验组与对照组的SW含量差异极显著;在实验组中,OW7.8与M1的SW含量无显著差异;在对照组中,OW7.8与M1的SW含量差异极显著。说明酵母氨酸还原酶促进真菌SW的合成,培养基中添加酵母氨酸对M1的SW合成影响更大。3.将功能互补载体pBARGPE-Sac转化至M1原生质体,经再生培养,获得sac功能互补菌株,互补株显示了潮霉素和草胺磷抗性;互补株中总DNA经PCR反应扩增出sac目的条带,经RT-PCR检测到sac和hph的表达。利用HPLC-MS测定了培养14 d的sac功能互补株、野生株OW7.8和sac敲除突变株M1中的SW含量,互补株高于OW7.8和M1。