论文部分内容阅读
目的糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一种临床常见的慢性代谢性疾病,持续高血糖状态会导致代谢紊乱,靶器官和大血管损伤,引起糖尿病足、视网膜病变、肾功能损伤等多种并发症。糖尿病肾病(diabetes nephrophathy,DN)是继发于糖尿病常见的微血管并发症之一,可引起终末期肾病(End stage renal disease,ESRD),是糖尿病患者死亡的重要因素。有研究报道,核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体参与了糖尿病肾病的发病过程,但其在DN发病分子机制中的作用尚不明确。既往研究发现脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk)参与疟原虫色素诱导的THP-1细胞中NLRP3炎症小体的活性调节,c-Jun氨基末端激酶(JNK)参与了巨噬细胞溶酶体裂解介导的NLRP3炎症小体的活化,但在糖尿病肾病的炎症损伤机制中Syk是否发挥作用及其与JNK、NLRP3炎症小体的关系尚未见报道。因此,本研究通过检测Syk、JNK及NLRP3炎症小体在1型糖尿病大鼠动物模型及高糖诱导的肾脏细胞中的表达,以探究Syk/JNK/NLRP3信号传导通路在糖尿病肾病发病机制中的作用。方法1.一次性腹腔注射65 mg/kg STZ溶液(1%STZ)构建1型糖尿病SD大鼠动物模型;2.对24h尿蛋白及大鼠肾脏重量与体重比值(肾重/体重,KW/BW)进行检测,以鉴定糖尿病肾病SD大鼠动物模型;3.HE(Hematoxylin-eosin)和PAS(Periodic Acid-Schiff)染色,光镜下观察SD大鼠肾脏组织结构的病理改变;4.Western Blot、RT-PCR和免疫组织化学染色检测NLRP3炎症小体及IL-1β在DN大鼠肾脏组织中的表达水平;5.Western Blot检测DN大鼠动物模型中p-Syk、p-JNK在肾脏组织中的表达水平;6.Western Blot检测p-Syk、p-JNK、NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β在高糖诱导的人肾小管上皮HK2细胞株中的表达水平;7.HK2细胞株经SP(JNK抑制剂)预处理2 h高糖培养24 h,Western Blot检测NLRP3炎症小体及IL-1β的表达水平;8.HK2细胞株和大鼠肾小球系膜细胞经BAY61-3606(Syk抑制剂)或Syk-si RNA预处理后高糖培养10 min或24 h,Western Blot检测p-JNK或NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β的表达水平;9.Western Blot和流式细胞术检测高糖诱导的HK2细胞的凋亡情况。结果1.成功构建1型糖尿病SD大鼠动物模型:一次性腹腔注射大剂量STZ 72 h后,DN组大鼠随机血糖高于16.7 mmol/L,可见“三多一少”症状。DN组随大鼠机血糖浓度明显高于Con组大鼠(P<0.001),且体重明显降低(P<0.05);2.成功构建糖尿病肾病SD大鼠动物模型:STZ注射8周后24 h尿蛋白明显升高(P<0.01),DN组大鼠KW/BW值明显高于Con组(P<0.05);3.HE染色结果显示,与Con组相比DN组大鼠肾脏组织结构紊乱,纤维化明显,肾小管上皮细胞增大并出现空泡变性。PAS染色结果显示,与Con组相比DN组大鼠肾脏组织可见基底膜增厚,系膜基质沉积;4.大鼠肾脏组织Western Blot结果显示DN组大鼠肾脏组织中NLRP3炎症小体及IL-1β的蛋白表达水平明显高于Con组(P<0.05);RT-PCR结果显示DN组大鼠肾脏组织中NLRP3炎症小体及IL-1β的m RNA水平明显高于Con组(P<0.05);免疫组织化学染色结果显示NLRP、caspase-1、mature IL-1β在DN大鼠肾脏组织中的表达水平明显高于Con组(P<0.01);5.大鼠肾脏组织Western Blot结果显示,与Con组相比,DN组大鼠肾脏组织中p-Syk、p-JNK的蛋白表达水平明显升高(P<0.001);6.Western Blot检测结果显示,高糖组(high glucose,HG组)诱导的HK2细胞中p-Syk、p-JNK、NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β的表达水平明显高于正常对照组(normal glucose,Con组)(P<0.05);7.HK2细胞Western Blot结果显示,抑制剂实验组(SP预处理2 h,然后25mmol/L葡萄糖培养)中NLRP3炎症小体及IL-1β的表达明显低于高糖组(25mmol/L)(P<0.01);8.Western Blot结果显示,HK2细胞株和大鼠肾小球系膜细胞经BAY61-3606或Syk-si RNA预处理后,25 mmol/L高浓度葡萄糖培养,抑制剂实验组和Syk-si RNA干扰组p-JNK或NLRP3炎症小体、IL-1β的表达水平明显低于高糖组(P<0.05);9.Western Blot结果显示,高糖组HK2细胞的凋亡水平明显高于正常对照组(P<0.001);抑制剂实验组(BAY61-3606预处理2 h,然后25 mmol/L葡萄糖培养)中HK2细胞的凋亡水平明显低于高糖组(P<0.05);流式细胞术检测结果与Western Blot结果一致。结论1.成功构建1型糖尿病SD大鼠动物模型;2.成功构建糖尿病肾病SD大鼠动物模型;3.p-Syk、p-JNK、NLRP3炎症小体及IL-1β在糖尿病肾病的发病机制中具有重要作用;4.Syk/JNK/NLRP3信号传导通路参与了糖尿病肾病的发病机制;5.Syk介导的HK2细胞凋亡与DN发病密切相关。