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研究目的：
自噬-溶酶体通路(Autophagy-lysosome pathway, ALP)和泛素-蛋白酶体通路(Ubiquitin-proteasome pathway, UPS)是细胞内两条重要的蛋白降解途径，两者功能障碍会引发或加剧阿尔茨海默病( Alzheimers disease，AD)中毒性蛋白的堆积。转录因子EB(TFEB)是ALP的重要调节因子，对维持中枢神经系统(centralnervous system, CNS)的正常功能具有重要作用。RCAN1( regulator of calcineurin1)作为钙调磷酸酶( Calcineurin)的调节因子，与AD的发病机制关系密切。本实验主要目的是明确TFEB在蛋白酶体抑制所诱导ALP激活中的作用与机制;RCAN1对TFEB及自噬的调控作用。
研究方法：
1.测定TFEB半衰期:放线菌酮(Cycloheximide，CHX)100μg/ml处理SH-SY5Y细胞，不同时间点收集细胞，提取总蛋白，Westem blot检测TFEB表达量。
2.探究TFEB降解途径:蛋白酶体抑制剂MG-132按时间或浓度梯度处理细胞，提取总蛋白，Western blot检测TFEB表达量。
3.观察TFEB核转位:MG-132处理HEK293细胞24h，抽提浆核蛋白，Westernblot检测TFEB表达量;或者HEK293细胞瞬时转染GFP-TFEB24h后，MG-132分别处理0（对照组）,3,6,12h，固定染色，共聚焦显微镜观察。
4.检测ALP活性:MG-132处理HEK293细胞24h，提取总RNA和总蛋白，qRT-PCR检测自噬，溶酶体相关基因LC3，LAMP1及CTSD转录水平;Western blot检测总LC3、LC3-Ⅱ及LAMP1表达量。或MG-132处理细胞24h后继续300 nMBafilomvcin A1处理4h，Westem blot检测LC3-Ⅱ表达量。
5.检测RCAN1.1L对TFEB及白噬的影响:SH-SY5Y细胞、SRNL细胞（稳转人源RCAN1，1L的SH-SY5Y细胞）培养相同时间后提取总RNA或总蛋白，RT-PCR检测TFEB转录水平，Western blot检测TFEB、p-ser142-TFEB及LC3-Ⅱ表达量。
研究结果：
1.CHX处理细胞约13.5h后，TFEB表达量减少至对照组(0h)的50％。
2.三种不同浓度的MG-132处理SH-SY5Y或HEK293细胞24h后，TFEB表达量均明显升高（*p＜0.05）:15μM MG-132按时间梯度处理HEK293细胞，TFEB表达量也明显升高（*p＜0.05）。且两组实验中，MG-132处理组磷酸化TFEB逐渐转变为非磷酸化形式，表现为由较高分子量转变为较低分子量。
3.与对照组相比，MG-132处理组胞核中TFEB表达量显著增多（*p＜0.05）。且随着时间推移，胞质中TFEB逐渐向核内转移，至12h后，绝大部分TFEB转移到核内。
4.与对照组相比，MG-132处理组LC3, LAMP1及CTSD转录水平明显升高（*p＜0.05），LAMP1、总LC3及LC3-Ⅱ表达量也均明显上调（*p＜0.05），且Bafilomvcin A1处理4h后会进一步上调MG-132导致的LC3-Ⅱ表达量的增多（*p＜0.05）。
5.TFEB的转录水平在SH-SY5Y和SRNL细胞中无明显差异（p＞0.05），但SRNL细胞中TFEB表达量明显减少（*p＜0.05）。
6.与对照组相比，SRNL细胞中的p-ser142-TFEB表达量明显增多（*p＜0.05）。LC3-Ⅱ表达量明显减少(P＜0.05)。
研究结论：
TFEB在SH-SY5Y细胞中的半衰期约为13.5h。在HEK293和SH-SY5Y细胞中，TFEB均通过UPS降解。抑制蛋白酶体不仅可以阻断TFEB降解，而且能使其发生去磷酸化与核转位，上调自噬相关基因的表达，提示TFEB可能在蛋白酶体抑制所诱导的ALP激活中发挥重要作用。此外，RCAN1.1L在不影响TFEB转录的前提下，可以明显下调TFEB的蛋白表达量，并上调其磷酸化水平，从而抑制自噬活性。
自噬-溶酶体通路(Autophagy-lysosome pathway, ALP)和泛素-蛋白酶体通路(Ubiquitin-proteasome pathway, UPS)是细胞内两条重要的蛋白降解途径，两者功能障碍会引发或加剧阿尔茨海默病( Alzheimers disease，AD)中毒性蛋白的堆积。转录因子EB(TFEB)是ALP的重要调节因子，对维持中枢神经系统(centralnervous system, CNS)的正常功能具有重要作用。RCAN1( regulator of calcineurin1)作为钙调磷酸酶( Calcineurin)的调节因子，与AD的发病机制关系密切。本实验主要目的是明确TFEB在蛋白酶体抑制所诱导ALP激活中的作用与机制;RCAN1对TFEB及自噬的调控作用。
研究方法：
1.测定TFEB半衰期:放线菌酮(Cycloheximide，CHX)100μg/ml处理SH-SY5Y细胞，不同时间点收集细胞，提取总蛋白，Westem blot检测TFEB表达量。
2.探究TFEB降解途径:蛋白酶体抑制剂MG-132按时间或浓度梯度处理细胞，提取总蛋白，Western blot检测TFEB表达量。
3.观察TFEB核转位:MG-132处理HEK293细胞24h，抽提浆核蛋白，Westernblot检测TFEB表达量;或者HEK293细胞瞬时转染GFP-TFEB24h后，MG-132分别处理0（对照组）,3,6,12h，固定染色，共聚焦显微镜观察。
4.检测ALP活性:MG-132处理HEK293细胞24h，提取总RNA和总蛋白，qRT-PCR检测自噬，溶酶体相关基因LC3，LAMP1及CTSD转录水平;Western blot检测总LC3、LC3-Ⅱ及LAMP1表达量。或MG-132处理细胞24h后继续300 nMBafilomvcin A1处理4h，Westem blot检测LC3-Ⅱ表达量。
5.检测RCAN1.1L对TFEB及白噬的影响:SH-SY5Y细胞、SRNL细胞（稳转人源RCAN1，1L的SH-SY5Y细胞）培养相同时间后提取总RNA或总蛋白，RT-PCR检测TFEB转录水平，Western blot检测TFEB、p-ser142-TFEB及LC3-Ⅱ表达量。
研究结果：
1.CHX处理细胞约13.5h后，TFEB表达量减少至对照组(0h)的50％。
2.三种不同浓度的MG-132处理SH-SY5Y或HEK293细胞24h后，TFEB表达量均明显升高（*p＜0.05）:15μM MG-132按时间梯度处理HEK293细胞，TFEB表达量也明显升高（*p＜0.05）。且两组实验中，MG-132处理组磷酸化TFEB逐渐转变为非磷酸化形式，表现为由较高分子量转变为较低分子量。
3.与对照组相比，MG-132处理组胞核中TFEB表达量显著增多（*p＜0.05）。且随着时间推移，胞质中TFEB逐渐向核内转移，至12h后，绝大部分TFEB转移到核内。
4.与对照组相比，MG-132处理组LC3, LAMP1及CTSD转录水平明显升高（*p＜0.05），LAMP1、总LC3及LC3-Ⅱ表达量也均明显上调（*p＜0.05），且Bafilomvcin A1处理4h后会进一步上调MG-132导致的LC3-Ⅱ表达量的增多（*p＜0.05）。
5.TFEB的转录水平在SH-SY5Y和SRNL细胞中无明显差异（p＞0.05），但SRNL细胞中TFEB表达量明显减少（*p＜0.05）。
6.与对照组相比，SRNL细胞中的p-ser142-TFEB表达量明显增多（*p＜0.05）。LC3-Ⅱ表达量明显减少(P＜0.05)。
研究结论：
TFEB在SH-SY5Y细胞中的半衰期约为13.5h。在HEK293和SH-SY5Y细胞中，TFEB均通过UPS降解。抑制蛋白酶体不仅可以阻断TFEB降解，而且能使其发生去磷酸化与核转位，上调自噬相关基因的表达，提示TFEB可能在蛋白酶体抑制所诱导的ALP激活中发挥重要作用。此外，RCAN1.1L在不影响TFEB转录的前提下，可以明显下调TFEB的蛋白表达量，并上调其磷酸化水平，从而抑制自噬活性。