目的：利用高保真度DNA聚合酶所介导的基因突变敏感性分子开关同时、快速、准确检测氨基糖苷类抗生素性耳聋相关的三个热点基因突变。方法：首先提取正常人的血液基因组DNA，根据人线粒体12S rRNA(NC01290)三个热点突变961delT、C1494T、A1555G区域设计包含三位点的扩增引物，利用低保真度DNA聚合酶进行引物延伸反应，并将PCR产物克隆到PMD19-T载体，得到包含三位点的野生型质粒。根据构建的野生型质粒序列，利用MutaPrimer2.0软件设计针对三个热点突变位点的三对互补的定点突变引物，以野生型质粒为模板，结合重叠延伸PCR反应和冷冻析出法产生同时包含三突变位点的突变目的片段，双酶切后克隆到载体中，得到同时包含三突变位点的突变型质粒。以这三位点为靶点，分别设计出3’末端与野生型质粒模板基因位点和突变型质粒模板位点相匹配的引物，经硫代磷酸化修饰后联合具有3’5’外切活性的高保真度DNA聚合酶共同构成基因突变敏感性分子开关，而后结合琼脂糖凝胶电泳，首先在不同反应体系中对包含三突变位点的突变阳性质粒模板分别进行检测，其次在同一反应体系对包含三突变位点的突变阳性质粒模板进行检测；最后用分子开关联合琼脂糖凝胶电泳对健康临床志愿者的DNA样本进行基因突变的筛查。结果：DNA测序结果证实利用改进的重叠延伸PCR进行三位点的定点突变成功获得同时包含三突变位点的突变型质粒模板。在不同反应体系中对三位点突变进行检测，结果显示，使用野生型质粒模板，突变敏感性分子开关能使完全匹配的野生型等位基因特异性检测引物延伸，而不配对的突变型等位基因特异性检测引物不能被延伸。反之，使用突变型质粒模板，突变敏感性分子开关能使完全匹配的突变型等位基因特异性检测引物延伸，而不配对的野生型等位基因特异性检测引物不能被延伸。在同一反应体系的多重引物延伸反应中，对三位点突变进行同时检测，同样，完全匹配引物延伸，不完全配对引物不被延伸。对正常健康志愿者的全血DNA样本进行检测，结果显示，野生型引物混合物与正常健康志愿者全血DNA样本完全匹配，有三条特异性引物产生，突变型引物混合物与正常健康志愿者全血DNA样本不完全匹配，无产物出现。结论：利用改进重叠融合PCR技术，成功获得同时含有氨基糖苷类抗生素性耳聋（Aminoglycoside antibiotics induced deafness, AAID）相关的三热点突变位点的阳性突变质粒，并且可用于基因检测。高保真度DNA聚合酶所介导的基因突变敏感性分子开关对AAID相关的单一热点突变检测具有较高的特异性和敏感性。高保真度DNA聚合酶介导的突变敏感性分子开关可用于多重引物延伸反应同时快速筛查AAID相关的三个热点突变。