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目的通过研究丹参酮IIA联合甲基强的松龙对ASCI后脊髓组织及神经元的保护作用,探讨丹参酮IIA能否替代或部分替代甲基强的松龙治疗ASCI,达到减少甲基强的松龙的用量,而又能获得相似的神经保护作用。同时通过研究丹参酮IIA对ASCI后轴突再生过程中相关抑制信号通路Rho A/ROCKII/MLC的影响,从传统中药中寻促进ASCI后轴突再生的有效成分。方法第一部分:大鼠大脑星形胶质细胞和脊髓神经元分层共培养体系的建立,通过分层培养的方法建立大鼠大脑星形胶质细胞和脊髓神经元共培养体系,经免疫荧光染色鉴定,用于进一步实验研究。第二部分:丹参酮IIA联合甲基强的松龙对大鼠ASCI后脊髓组织的保护作用1、MTT法检测丹参酮IIA最适神经元培养浓度;建立体外脊髓神经元损伤模型;实验分组,Sham组:空白对照组,神经元正常培养;ASCI组:损伤对照组,神经元做损伤模型,神经元正常培养;TIIA组:制成神经元损伤模型,加含10μM丹参酮IIA的神经元培养液培养;MP组:制成神经元损伤模型,加含1μM甲基强的松龙的神经元培养液进行细胞培养;TIIA+MP组:制成神经元损伤模型,加含10μM丹参酮IIA和0.5μM甲基强的松龙的神经元培养液培养。细胞培养24小时后收集细胞进行分析。24h后Western Blot法检测神经元内Caspase-3、Bcl-2和Bax的表达。2、Allen打击法建立体内大鼠T9节段脊髓急性脊伤模型,根据实验设计,将造模成功的60只SD大鼠分为5组,Sham组:空白对照组,作T9椎板切除,不作急性脊髓损伤打击模型,正常饲养;ASCI组:损伤对照组,作T9椎板切除,并作急性脊髓损伤打击模型,正常饲养;TIIA组:作T9椎板切除,并作急性脊髓损伤打击模型,给予丹参酮IIA 30mg/kg/d 药物治疗;MP组:作T9椎板切除,并作急性脊髓损伤打击模型,给予甲基强的松龙30mg/kg药物治疗;TIIA+MP组:作T9椎板切除,并急性脊髓损伤作打击模型,给予丹参酮IIA 30mg/kg/d和甲基强的松龙20mg/kg药物治疗。BBB评分法评估大鼠术后运动功能恢复情况。第1天RT-PCR法检测脊髓组织内Caspase-3 m RNA和NF-κB m RNA的表达,Western Blot法检测各组第1天脊髓组织内NF-κB的表达和第7天脊髓组织内Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达量。第1、7天检测大鼠脊髓组织中SOD活性和MDA的含量,第3天用免疫荧光双标法检测大鼠脊髓组织神经元内Caspase-3的表达量。第三部分丹参酮IIA对大鼠ASCI后Rho A/ROCKII/MLC信号通路表达的影响1、大鼠脊髓神经元和星形胶质细胞共培养体系的建立及损伤模型同第二部分,实验分组,Sham组:空白对照组,神经元正常培养;ASCI组:损伤对照组,神经元做损伤模型,神经元正常培养;TIIA组:制成神经元损伤模型,加含10μM丹参酮IIA的神经元培养液培养;Fasudil组:制成神经元损伤模型,加含10μM法舒地尔的神经元培养液进行细胞培养。细胞培养24小时后收集细胞进行分析。细胞损伤后24h RT-PCR法检测神经元内Rho A m RNA和ROCKII m RNA表达量,Western Blot法检测神经元内Rho A、ROCKII、MLC和p-MLC的表达。2、建立大鼠急性脊髓损伤模型同第二部分,实验分组,Sham组:空白对照组,作T9椎板切除,正常饲养;ASCI组:损伤对照组,作T9椎板切除,并作急性脊髓损伤打击模型,正常饲养。TIIA组:作T9椎板切除,并作急性脊髓损伤打击模型,给以丹参酮IIA 30mg/kg/d药物治疗。Fasudil组:作T9椎板切除,并作急性脊髓损伤打击模型,给予法舒地尔10mg/kg/d药物治疗。根据实验设计,于术后1天和7天各组取4只大鼠处死取材用于检测各项指标。BBB评分法评估大鼠术后运动功能。大鼠ASCI后第1天RT-PCR法检测大鼠脊髓组织内Rho A m RNA和ROCKII m RNA表达水平,术后第1、7天Western Blot法检测Rho A、ROCKII、MLC和p-MLC的表达。结果第一部分:1.1原代星形胶质细胞接种后4h后显微镜下观察可见部分细胞贴壁,胞体为圆形,透光性强,未见明显的突起伸出。24小时后可见星形胶质细胞贴壁,位于培养瓶的底层,胞体扁平,呈三角形、菱形或者多边形,部分细胞伸出多个粗短的突起,7-9天时可见细胞间相互融合约70%-80%时,可以进行传代;1.2传代的星形胶质细胞贴壁较快,接种后1-2小时大多数细胞已经贴壁,第二天可见胞体变大,形态不规则;传代培养4-5天后细胞贴壁紧密,胞体呈布块状贴壁,相互之间接触。1.3原代脊髓神经元接种后4h后显微镜下观察可见部分细胞贴壁,胞体为圆形,透光性强,未见明显的突起伸出。第二天换液可见多数神经元细胞贴壁。第二部分:2.1损伤后各组大鼠BBB评分均为0分。大鼠脊髓损伤后第1、2天,MP组的SD大鼠BBB评分显著高于TIIA组(P<0.05),与TIIA+MP组无显著性差异(P>0.05)。第5至7天,TIIA组和TIIA+MP组大鼠BBB运动功能评分高于MP组(P<0.05)。2.2大鼠脊髓损伤后第1天,ASCI组大鼠的脊髓组织内Caspase-3m RNA和NF-κB m RNA表达水平明显高于其余各组(P<0.05)。TIIA+MP组大鼠脊髓内Caspase-3 m RNA和NF-κB m RNA表达水平较MP组无显著升高(P>0.05)。2.3大鼠脊髓损伤后第7天,MP组和TIIA+MP组大鼠脊髓组织内的Bax和Caspase-3表达水平较ASCI组显著降低(P<0.05),Bcl-2表达水平显著升高(P<0.05)。TIIA组的Bcl-2表达量与ASCI组没有显著差异(P>0.05),Bax和Caspase-3表达水平明显下降(P<0.05)。TIIA组和MP组大鼠的脊髓组织内的Bax和Caspase-3表达水平较TIIA+MP组显著升高(P<0.05),Bcl-2表达水平显著降低(P<0.05)。在脊髓神经元内,ASCI组大鼠脊髓神经元Bax和Caspase-3表达水平较其余各组明显升高(P<0.05),Bcl-2表达水平显著下降(P<0.05)。MP组神经元内Caspase-3、Bax和Bcl-2表达水平较TIIA+MP组无显著差异(P>0.05)。TIIA组脊髓神经元内Bcl-2表达水平显著低于TIIA+MP组(P<0.05),而两组Caspase-3和Bax的表达水平则无显著差异(P>0.05)。与ASCI组比较,所有药物治疗组大鼠脊髓组织内和神经元内Bcl-2/Bax明显升高(P<0.05),TIIA组大鼠脊髓组织内和神经元内Bcl-2/Bax比值显著低于MP组和TIIA+MP组(P<0.05)。TIIA+MP组与MP组Bcl-2/Bax比值无显著性差异(P>0.05)。2.4大鼠脊髓损伤后第1天和第7天,MP组大鼠脊髓组织内SOD含量较ASCI组显著升高(P<0.05),而MDA的含量则显著降低(P<0.05)。TIIA+MP组大鼠脊髓组织内MDA的含量较TIIA组显著降低(P<0.05),而SOD的含量较TIIA组无显著差别(P>0.05)。MP组大鼠脊髓组织内SOD和MDA的含量和TIIA+MP组无显著差异(P>0.05)。2.5大鼠脊髓损伤后第1天,ASCI组大鼠脊髓组织内NF-κB的表达水平较其它组显著升高(P<0.05)。TIIA+MP组的脊髓组织内NF-κB水平低于MP组,但无显著性差异(P>0.05)。2.6根据MTT检测结果,选择10μM作为后续实验的最佳的丹参酮IIA浓度来培养神经元。在ASCI组神经元在机械性损伤后24小时OD值较其他组显著下降(P<0.05)。TIIA+MP组神经元的活力是高于MP组,但无显著差异(P>0.05)。2.7大鼠脊髓损伤后第3天免疫组织化学实验的结果显示,TIIA组大鼠脊髓组织内Caspase-3的表达量较ASCI组无显著差异(P>0.05),MP组和TIIA+MP组脊髓组织内Caspase-3的表达量较ASCI组显著降低(P<0.05),MP组脊髓组织内Caspase-3的表达量较TIIA+MP组无显著差异(P>0.05)。第三部分:3.1 TIIA组和Fasudil组的大鼠在各个时间点BBB评分无显著性差异(P>0.05)。第2天至第7天,TIIA组和Fasudil组大鼠BBB运动功能评分显著高于ASCI组(P<0.05)。3.2 ASCI组脊髓神经元内的Rho A和ROCKII表达水平明显较其它组显著上升(P<0.05)。Fasudil组脊髓神经元内ROCKII表达量较TIIA组大鼠的脊髓组织内的ROCKII表达水平无显著差异(P>0.05),而Rho A的表达量较TIIA组显著减少(P<0.05)。大鼠脊髓损伤后第1天和第7天,ASCI组大鼠脊髓组织内Rho A和ROCKII的表达水平较其它组显著升高(P<0.05)。大鼠脊髓损伤后第1天,Fasudil组大鼠脊髓组织内Rho A和ROCKII表达量较TIIA组显著升高(P<0.05)。大鼠脊髓损伤后第7天时,TIIA组大鼠的脊髓组织内的Rho A和ROCKII表达水平较Fasudil组显著升高(P<0.05)。3.3大鼠脊髓损伤后第1天,ASCI组大鼠脊髓组织内Rho A m RNA和ROCKII m RNA的表达量较其它组显著升高(P<0.05)。Fasudil组Rho A m RNA和ROCKII m RNA的表达量较TIIA组显著降低(P<0.05)。在机械损伤的脊髓神经元内,ASCI组神经元内Rho A m RNA和ROCKII m RNA的表达量较其它组显著升高(P<0.05)。Fasudil组Rho A m RNA和ROCKII m RNA的表达量较TIIA组低,但无显著性差异(P>0.05)。3.4在脊髓神经元中,ASCI组脊髓神经元内MLC表达量较其它组无显著差异(P>0.05),p-MLC表达量较其它组显著升高(P<0.05);TIIA组脊髓神经元内p-MLC表达较Fasudil组低,但无显著性差异(P>0.05);在各组脊髓神经元内,ASCI组脊髓神经元内p-MLC/MLC比值较其它组显著升高(P<0.05);TIIA组脊髓神经元内p-MLC/MLC的比值较与Fasudil组显著降低(P<0.05)。大鼠脊髓损伤后第1天,ASCI组大鼠脊髓组织内MLC表达量与其它组无显著差异(P>0.05),p-MLC表达量较其它组显著升高(P<0.05);TIIA组大鼠脊髓组织内p-MLC表达较Fasudil组低,但无显著性差异(P>0.05);各组大鼠脊髓组织内,ASCI组大鼠脊髓组织内p-MLC/MLC比值较其它组显著升高(P<0.05);TIIA组大鼠脊髓组织内p-MLC/MLC的比值较Fasudil组低,但无显著性差异(P>0.05)。大鼠脊髓损伤后第7天,ASCI组大鼠脊髓组织内MLC表达量较其它组无显著差异(P>0.05),p-MLC表达量较其它组显著升高(P<0.05);TIIA组大鼠脊髓组织内p-MLC表达量量较Fasudil组显著升高(P<0.05)。各组大鼠脊髓组织内,ASCI组大鼠脊髓组织内p-MLC/MLC比值较其它组显著升高(P<0.05);TIIA组大鼠脊髓组织内p-MLC/MLC比值较Fasudil组显著升高(P<0.05)。结论1.根据免疫组织鉴定结果,我们获得了星形胶质细胞和神经元分层共培养体系,用于进一步的实验研究。2.同甲基强的松龙治疗作用相似,丹参酮IIA可以通过其抗氧化、抑制炎性相关因子分泌和抗凋亡等药理作用来发挥对ASCI后脊髓组织保护作用。丹参酮IIA联合低剂量甲基强的松龙治疗ASCI能够减少ASCI后甲基强的松龙的使用量,而又能获得类似神经保护作用。3.ASCI后Rho A/ROCKII/MLC信号通路激活,参与抑制轴突再生过程。和法舒地尔作用相似,TIIA可以能够抑制ASCI后Rho A/ROCKII/MLC信号通路,减少Rho A、ROCKII的表达,抑制MLC磷酸化过程,减少p-MLC的形成,促进神经轴突再生和ASCI后脊髓神经功能的恢复。