β2微球蛋白(β2-microglobulin,B2M)是新近发现的一种内源性致抑郁、焦虑的分子。大量的资料显示,疾病状态下,B2M的生成明显增加,提示B2M参与了其他疾病与抑郁共病。因此,探讨防治B2M所致抑郁的方法对治疗其他疾病与抑郁共病具有重要意义。Itaconate是三羧酸循环的代谢产物,发挥了广泛的抗炎效果。考虑到神经炎症反应在抑郁和焦虑的发生中具有重要的地位,我们将探讨Itaconate对B2M诱导抑郁和焦虑样行为的拮抗作用及其机制。犬尿氨酸通路(Kynurenine pathway,KP)是脑内色氨酸代谢的重要通路。正常生理状态下,KP下游产物喹啉酸(Quinolinic acid,QA)通过喹啉酸磷酸核糖转移酶(Quinolinate phosphoribosyl transferase,QPRT)转化成NAD+,维持机体机能稳态。在应激状态下,KP代谢发生紊乱,导致QA堆积、NAD+生成减少,成为产生抑郁和焦虑样症状的重要因素。那么,Itaconate可否通过纠正海马KP代谢紊乱抑制B2M诱导的抑郁和焦虑样行为呢?为了回答上述科学问题,我们将按以下四个部分进行研究:(1)明确Itaconate可拮抗B2M诱导的抑郁和焦虑样行为、减轻大鼠海马神经炎症反应以及改善大鼠海马突触可塑性损伤;(2)明确Itaconate可纠正B2M暴露大鼠的海马KP代谢紊乱;(3)明确KP代谢失衡所致的QA堆积可诱导抑郁和焦虑样行为、海马神经炎症以及突触可塑性紊乱;(4)明确阻断QA转化成NAD+(QA堆积)可取消Itaconate对B2M诱导抑郁和焦虑样行为的拮抗作用。第一部分Itaconate对B2M诱导抑郁和焦虑样行为的拮抗作用、对海马神经炎症反应以及海马突触可塑性紊乱的改善作用目的:B2M作为一个重要的神经免疫蛋白,已证实为机体内重要的抑郁诱导因子。海马神经炎症的发生可损伤突触可塑性,并促进抑郁和焦虑样症状的发展。Itaconate是一种抗炎代谢产物。为此,我们将探讨Itaconate对B2M诱导抑郁和焦虑样行为的拮抗作用,并从调控海马神经炎症和突触可塑性两个方面阐明其作用机制。方法:SD大鼠侧脑室分别给予B2M(0.9 μg,1 μl,single dose,i.c.v.)和 OI(4-Octyl-Itaconate,Itaconate 衍生物,0.06 mg,0.18 mg,0.6 mg,3 μl,single dose,i.c.v.),大鼠于给药6天后进行行为学检测,糖水偏好实验(Source preference test,SPT)、悬尾实验(Tail suspension test,TST)和强迫游泳实验(Forced swimming test,FST)评估大鼠的抑郁样行为;新环境进食抑制实验(Novelty-suppressed feeding test,NSFT)、高架十字迷宫实验(Elevated plus-maze test,EPMT)评估大鼠焦虑样行为;旷场实验(Open field test,OFT)评估大鼠运动功能和焦虑样行为。免疫荧光检测海马CA1、CA3和DG区小胶质细胞活化状态,Meso Scale Discovery(MSD)检测海马炎症因子水平;免疫荧光检测海马CA1、CA3和DG区突触可塑性相关蛋白突触蛋白酶1(Synapsin 1,SYN1)、突触素(Synaptophysin,SYP)、微管相关蛋白 2(Microtubule-associated protein 2,MAP2)和突触后密度蛋白 95(Postsynaptic density protein 95,PSD95)的表达,透射电镜观察海马突触超微结构的变化。结果:1.Itaconate 拮抗 B2M 诱导的抑郁样行为:OI(4-Octyl Itaconate,Itaconate衍生物)可显著增加B2M暴露大鼠在SPT中的糖水偏好率,降低B2M暴露大鼠在TST中的不动时间,明显缩短B2M暴露大鼠在FST中的不动时间,表明Itaconate对B2M诱导的抑郁样行为具有改善作用。2.Itaconate拮抗B2M诱导的焦虑样行为:OI显著增加B2M暴露大鼠在OFT中央区域路程;OI还缩短B2M暴露大鼠在NFST中的摄食潜伏期,而10 min内摄食总量无明显差异;此外,OI可明显增加B2M暴露大鼠在EMPT中的进入开放臂次数比和开放臂时间比,而总穿臂次数无明显变化。以上结果表明Itaconate对B2M诱导的焦虑样行为具有拮抗作用。3.Itaconate减轻B2M暴露大鼠的海马神经炎症反应:免疫荧光结果显示B2M暴露大鼠海马CA1,CA3和DG区小胶质细胞IBA1和CD68表达增多,与CD68共定位增加,提示B2M暴露大鼠海马小胶质细胞过度激活。而侧脑室给予OI后,显著降低了小胶质细胞IBA1、CD68的表达以及与CD68共定位比率。同时,MSD结果表明B2M暴露大鼠海马促炎因子TFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6和KC/GRO水平增多,而抗炎因子IL-4、IL-5、IL-10和IL-13水平降低;给予OI后,显著降低B2M暴露大鼠海马促炎因子水平、恢复其抗炎因子水平,表明Itaconate拮抗B2M暴露大鼠海马炎症反应。4.Itaconate改善B2M暴露大鼠的海马突触可塑性障碍:免疫荧光结果显示B2M暴露大鼠海马CA1,CA3和DG区突触相关蛋白SYN1、SYP、MAP2和PSD95表达明显降低;而侧脑室给予OI后,显著上调了 SYN1、SYP、MAP2和PSD95表达。此外,透射电镜结果表明B2M暴露大鼠海马CA1,CA3和DG区突触数密度、面密度、界面曲率、突触活性区长度和突触后致密物(Postsynaptic density,PSD)厚度显著减少,而突触间隙明显增加;给予OI后,B2M暴露大鼠海马CA1,CA3和DG区突触数密度、突触面密度、突触界面曲率、突触活性区长度和PSD厚度明显增加,而突触间隙显著减少。以上结果表明Itaconate可改善B2M暴露大鼠的海马突触可塑性紊乱。小结:Itaconate对B2M暴露大鼠的抑郁和焦虑样行为具有拮抗作用,其机制涉及到对B2M所致海马神经炎症反应和突触可塑性损伤的改善作用。第二部分Itaconate纠正B2M暴露大鼠海马的KP代谢紊乱目的:KP代谢紊乱是诱导神经炎症反应重要因素,对抑郁症的发生至关重要。为深入揭示Itaconate抗抑郁作用的机制,我们将进一步探讨Itaconate对B2M暴露大鼠海马KP代谢紊乱的纠正作用。方法:Western Blot检测海马吲哚胺-2,3-双加氧酶(Indoleamine2,3-dioxygenasel,IDO)、犬尿氨酸单加氧酶(Kynurenine monooxygenase,KMO)、犬尿氨酸酶(Kynureninase,KYNU)、3-羟基邻氨基苯甲酸 3,4-双加氧酶(3-hydroxyanthranilate 3,4-dioxygenase,HAAO)和喹啉酸磷酸核糖转移酶(Quinolinate phosphoribosyl transferase,QPRT)的表达,液相色谱-串联质谱(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)方法检测大鼠海马KP代谢产物犬尿氨酸(Kynurenine,KYN)、3-羟基犬尿氨酸(3-hydroxykynurenine,3-HK)、3-羟基邻氨基苯甲酸(3-hydroxyanthranilic acid,3HAA)、喹啉酸(Quinolinic acid,QA)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)的水平。结果:1.Itaconate调控KP代谢途径关键酶的表达:Western Blot结果显示B2M暴露大鼠海马IDO、KMO、KYNU和HAAO的表达增多,而QPRT的表达减少;OI处理后,B2M暴露大鼠海马IDO、KMO、KYNU和HAAO的表达水平明显下降,QPRT的表达水平显著增强,表明Itaconate对B2M暴露大鼠海马KP代谢具有调控作用。2.Itaconate调控KP代谢产物水平:LC-MS/MS结果表明B2M暴露大鼠海马中间产物KYN、3HK、3HAA和QA增多,而NAD+生成减少,表明B2M暴露大鼠海马KP代谢失衡。给予OI后,B2M暴露大鼠海马中间产物KYN、3HK、3HAA和QA明显减少,NAD+生成增加,表明Itaconate可恢复B2M暴露大鼠海马KP代谢平衡。小结:Itaconate可纠正B2M暴露大鼠海马的KP代谢紊乱。第三部分喹啉酸对大鼠抑郁和焦虑样行为、海马神经炎症反应以及突触可塑性紊乱的诱导作用目的:KP代谢紊乱一个重要标志就是大量的喹啉酸(Quinolinic acid,QA)堆积。我们前面发现Itaconate的抗抑郁作用涉及到减轻QA堆积,为更加深入明确纠正KP代谢紊乱、减轻QA堆积是Itaconate抗B2M所致抑郁和焦虑的关键环节,我们还将明确QA具有诱导海马神经炎症反应、突触可塑性紊乱、抑郁和焦虑样行为的作用。方法:SD大鼠侧脑室给予喹啉酸(Quinolinic acid,QA,50 nmol,150 nmol,500 nmol,1 μl,single dose,i.c.v.),给药 6 天后观察大鼠抑郁和焦虑样行为学改变,免疫荧光检测海马CA1、CA3和DG区小胶质细胞活化状态,MSD检测海马炎症因子水平;免疫荧光检测海马CA1,CA3和DG区突触可塑性相关蛋白SYN1、SYP、MAP2和PSD95的表达,透射电镜观察海马突触超微结构的变化。结果:1.QA诱导大鼠产生抑郁样行为:与对照组相比,QA处理的大鼠在SPT中的糖水偏好率明显降低、在TST中的不动时间增多、在FST中的不动时间增多,表明QA可诱导大鼠产生抑郁样行为。2.QA诱导大鼠产生焦虑样行为:与对照组相比,QA处理的大鼠在OFT中央区域路程明显减少;在NFST中摄食潜伏期显著延长,而各组大鼠10 min内摄食总量无明显差异;此外,QA处理的大鼠在EPMT中进入开放臂次数比和开放臂时间比明显减少,而总穿臂次数无明显变化。以上结果表明QA可诱导大鼠产生焦虑样行为。3.QA引起大鼠海马神经炎症反应:与对照组相比,免疫荧光显示QA处理的大鼠海马CA1、CA3和DG区IBA1、CD68表达增加,同时与CD68共定位比率增多。此外,MSD结果表明QA处理的大鼠海马促炎因子TFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6和KC/GRO生成增多,而抗炎因子IL-4、IL-5、IL-10和IL-13水平降低。以上结果表明QA可诱导大鼠海马神经炎症的发生。4.QA导致大鼠海马突触可塑性紊乱:免疫荧光结果表明,与对照组相比,QA处理的大鼠海马CA1、CA3和DG区突触相关蛋白SYN1、SYP、MAP2和PSD95表达明显降低;在透射电镜下,QA处理的大鼠海马CA1,CA3和DG区突触数密度、突触面密度、突触界面曲率、突触活性区长度和PSD厚度明显降低,而突触间隙显著增加。以上结果表明QA可引起大鼠海马突触可塑性紊乱。小结:QA可诱导抑郁和焦虑样行为,其机制与其诱导海马神经炎症反应和突触可塑性紊乱密切相关。第四部分阻断QA转化为NAD+可逆转Itaconate对B2M诱导抑郁和焦虑样行为的拮抗作用目的:QA作为KP代谢中的重要活性分子,其水平的增多代表了 KP途径的激活以及KP代谢的紊乱。而Itaconate可调控B2M暴露大鼠海马内KP代谢,通过减少脑内QA的聚集以及促进NAD+的生成,进而恢复KP代谢平衡。为进一步明确Itaconate对B2M诱导抑郁和焦虑样行为的拮抗机制在于纠正KP代谢失衡、促进QA转化为NAD+,我们还将使用喹啉酸磷酸核糖转移酶(Quinolinate phosphoribosyl transferase,QPRT)特异性抑制剂酞酸(Phthalic acid,PA)抑制QA转化为NAD+、诱导KP代谢失衡,探讨阻断QA转化为NAD+这一过程是否能逆转Itaconate对B2M诱导抑郁和焦虑样行为的拮抗作用。方法:SD大鼠侧脑室分别给予B2M(0.9 μg,1 μl,single dose,i.c.v.)、OI(4-Octyl Itaconate,Itaconate 衍生物,0.18 mg,3 μl,single dose,i.c.v.)和 PA(QPRT 特异性抑制剂,500 μM,1 μl,single dose,i.c.v.)。给药6天后,LC-MS/MS检测大鼠海马QA和NAD+水平;免疫荧光检测海马CA1、CA3和DG区突触可塑性变化,透射电镜观察海马突触超微结构的改变;免疫荧光检测海马CA1、CA3和DG区小胶质细胞活化状态,MSD检测海马炎症因子水平;行为学检测大鼠抑郁和焦虑样行为学改变。结果:1.PA阻断Itaconate对B2M暴露大鼠海马NAD+生成的促进作用:LC-MS/MS结果表明,PA取消了 OI对B2M暴露大鼠海马NAD+生成的促进作用,提示PA逆转了 OI对B2M暴露大鼠海马KP代谢平衡的恢复作用。2.抑制OA转化为NAD+可阻断Itaconate对B2M暴露大鼠海马神经炎症的改善作用:PA逆转OI对B2M暴露大鼠海马CA1、CA3和DG区IBA1和CD68表达的下调作用,并取消OI对B2M暴露大鼠海马促炎因子生成的降低作用和对抗炎因子生成的增强效应,表明阻断Itaconate对B2M暴露大鼠海马KP代谢紊乱的纠正作用可逆转Itaconate对B2M暴露大鼠海马神经炎症反应的拮抗作用。3.抑制OA转化为NAD+可取消Itaconate对B2M暴露大鼠海马突触可塑性的改善作用:PA逆转OI对B2M暴露大鼠海马CA1、CA3 和 DG 区 SYN1、SYP、MAP2 和 PSD95 表达的上调作用,对B2M暴露大鼠海马CA1、CA3和DG区的突触数密度、突触面密度、突触界面曲率、突触活动区长度和PSD厚度的增加作用,以及对B2M暴露大鼠海马突触间隙宽度的降低作用,表明阻断Itaconate对B2M暴露大鼠海马KP代谢紊乱的纠正作用可逆转Itaconate对B2M暴露大鼠海马突触可塑性的改善作用。4.抑制OA转化为NAD+可逆转Itaconate对B2M诱导抑郁样行为的拮抗作用:PA明显逆转OI对B2M暴露大鼠在FST中糖水偏好率的增加作用,明显抑制OI对B2M暴露大鼠在 TST中不动时间的减少。此外,PA显著抑制OI对B2M暴露大鼠在FST中不动时间的减少。以上结果表明取消Itaconate对B2M暴露大鼠海马KP代谢紊乱的纠正作用可逆转Itaconate对B2M暴露大鼠抑郁样行为的拮抗作用。5.抑制OA转化为NAD+可逆转Itaconate对B2M诱导焦虑样行为的拮抗作用:PA显著降低OI对B2M暴露大鼠在OFT中央区域路程的增加作用;明显逆转OI缩短B2M暴露大鼠在NFST中的摄食潜伏期,而各组大鼠10 min内摄食总量无差异。同时,PA明显逆转OI对B2M暴露大鼠在EPMT中进入开壁次数百分比和开臂停留时间百分比的增加作用,但不影响各组大鼠进入开闭壁的总次数。上述结果表明取消Itaconate对B2M暴露大鼠海马KP代谢紊乱的纠正作用可逆转Itaconate对B2M暴露大鼠焦虑样行为的拮抗作用。小结:抑制QA转化为NAD+取消了 Itaconate对B2M暴露大鼠海马神经炎症反应、突触可塑性紊乱以及抑郁和焦虑样行为的拮抗作用。结 论Itaconate通过恢复海马KP代谢平衡,减轻海马神经炎症,改善海马突触可塑性,进而拮抗B2M诱导的抑郁和焦虑样行为。