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目的：1、研究肝癌病人外周血树突状细胞表面分子的表达情况。2、对比肝癌病人和健康人DC表型的差异及免疫功能状态。3、人IL-2基因腺病毒载体的构建和包装。4、研究树突状细胞经IL-2基因转染后表型和功能状态的变化。5、转基因DC经抗原负载后诱导的特异性杀伤作用的探讨。 方法： 1、健康人和肝癌病人外周血DC的分离、培养和鉴定 采集健康人和肝癌病人外周血，经淋巴细胞分离液分离出外周血单个核细胞，贴壁培养2小时后，弃上清，取贴壁单核细胞，以含GM-CSF 500μ／ml、IL-4500μ／ml RPMI-1640培养基诱导培养，每隔1天半量换液，至第6天添加TNFα200μ／ml促进成熟。以共聚焦显微镜和电子显微镜拍摄细胞照片，流式细胞术鉴定DC，3H-TdR掺入法测定DC对淋巴细胞的激活功能，并对照肝癌病人和健康人DC间的差异，推测两组DC免疫状态的不同。 2、人IL-2基因腺病毒载体的构建和包装 将含目的基因的质粒pcDNA3用PCR扩增IL-2基因片段，并引入xbaI、kpnI限制性酶切位点，将该基因片段与同样经xbaI、kpnI酶切的线性化 南京医科大学博士学位论文pshuttle质粒重组，构建pshuttl叭L一2真核表达载体，转化大肠杆菌JM 109，再以pl一seel八一eeul双酶切pshuttle质粒，切出含IL一2基因的eDNA片段，加入同样经PI一Seel八一eeul双酶切的线性化Adeno一x病毒DNA，重组Ad一ILZ腺病毒载体。酶切鉴定阳性克隆，Westem blot印迹测定IL一2基因的表达。 3、树突状细胞经IL一2基因转染后的表型改变 健康组和肝癌组Dc培养至第6天，以ro0P何细胞的比例加入重组Ad一IL一2腺病毒载体，转染6小时，添加TNF a 200林加l，并负载肿瘤抗原促进DC成熟，培养至第9天，以流式细胞术测定其表面分子的表达并与未转基因DC作对照;M竹法检测转基因DC表达的IL一2活性。推测经IL一2基因转染后DC免疫功能状态的变化。 4、转IL一2基因DC所诱导的特异性免疫杀伤测定 （l）DC经IL一2基因转染后，培养至第9天，按DC:T为1:4、1:20、1:100与淋巴细胞混合，以3H一TdR掺入法测定T淋巴细胞的增殖情况，算出DC的刺激指数。同时收集DC:T为1:20条件下CTL上清，以ELisA法检测IFN，的量，了解IL一2基因修饰DC对其所激活的CTL活性的影响。 （2）健康组DC在不同状态下诱导的CTL，分组按E:T为ro:1、30:1、100:1的比例与靶细胞混合培养，以5’c:释放法测定cTL的细胞毒性。 实验组cPm一自然释放组cPm 细胞毒性%二—xloo% 最大释放组cPm一自然释放组cPm 南京医科大学博士学位论文 对比IL一2基因修饰对结果的影响。 （3）不同状态下的健康组和肝癌组DC所诱导激活的CTL，分组分别在荷瘤裸鼠成瘤后第1、3周瘤旁皮下接种治疗，观察肿瘤的生长情况。 结果: l、健康人和肝癌病人的成熟DC是悬浮不贴壁的，表面有大量毛刺，胞浆内富含线粒体，溶酶体较少。肝癌病人DC表面表达的cDla与健康人无差异（P>O.05），而其他分子表达的阳性率分别为Cns。58.85%、eD8646.18%、CD40 30.85%、HLA一DR 45.86%，较正常健康人低P<0.01。且肝癌病人对自体和同种异体的淋巴细胞的激活作用较弱。 2、经PCR扩增的IL一2 enNA片段引入xbal、kpnl酶切位点，经xbal/kpnl双酶切pshuttle质粒后成功构建pshuttl叭L一2真核表达载体，转化大肠杆菌后，阳性克隆经酶切鉴定和序列分析鉴定。以PI一sce班一eeul双酶切pshuttl“质粒，切出的含IL一2的cDNA成功插入同样经PI一see班一eeul双酶切的腺病毒载体，经酶切鉴定，感染293细胞，Westem blot出现特异性蛋白条带，表明重组腺病毒载体能稳定表达IL一2。病毒滴度losp似ml。 3、DC经IL一2基因转染后其表面分子表达的阳性率分别为:健康组CD一。88.75%、CDso 87.19%、CD86 84.92%、CD4o 78.80%、HLA一DR 8 1 .54%;肝癌组 CDI。82.97%、CDso 78.47%、CDs6 79.12%、CD4。69.80%、HLA一DR76.17%，其共刺激分子CDso、CDs6、CD4。和HLA一DR皆较未转基因的为高。尤其是肝癌组经转基因后其活性分子表达的阳性率增高更为明显。而且转基因后共刺激分子和HLA一DR分子的平均荧光强度明显增强。Mrl，1， 南京医科大学博士学位论文检测结果发现转IL一2基因DC有较大量的IL一2的表达。 4、健康组和肝癌组转IL一2基因DC对淋巴细胞的刺激指数分别为未转基因的2.5倍和7倍。两组中转基因DC激活的CTL所表达的IFN一，较未转基因DC激活的CTL所表达的明显增加，因而转基因DC能更好地激发体内的细胞免疫。 5、经DC激活的CTL治疗后，荷瘤裸鼠肿瘤的生长受到明显的抑制。实验组中尤以转基因DC组的生长抑制作用最强。 结论: l、在本实验的细胞因子组合下:GM一CSF 500林加l、IL一4 500林/ml、TNF a 200林/ml，能