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为弥补微生物学和血清学方法在布鲁氏菌检测中的不足,以及探索、建立一种快速、准确的布鲁氏菌基因分型方法,本研究开展了以下三个方面的研究:首先,通过对已发表的布鲁氏菌属、种、型基因序列进行分析,寻找出布鲁氏菌种、型特异性基因分布规律,设计引物,运用VirB8-PCR,AMOS-PCR,B1-PCR方法对布鲁氏菌属、种、型进行鉴定。与此同时,依据聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)原理,建立Ery-PCR-SSCP方法,用于牛种A19疫苗株与野毒株的区分鉴定。其次,以布鲁氏菌致病力因子VirB7下游至VirB9上游基因序列为目的扩增片段,设计上、下游引物,优化血样、奶样中布鲁氏菌基因组DNA的提取方法,建立布鲁氏菌内参PCR(IR-PCR)检测方法,用于血液、奶液样本中布鲁氏菌的检测,以达到降低普通PCR法在检测布鲁氏菌中的假阴性率。最后,对本实验室前期研制的布鲁氏菌VirB8基因PCR试剂盒进行组装,并对试剂盒各项特性(特异性、敏感性、保存期、可重复性)进行评测。同时应用该试剂盒对新疆、山西的2批65份血样进行了检测,评估该试剂盒的临床稳定性。通过试验研究,获得以下结果:(1)VirB8-PCR,AMOS-PCR,B1-PCR方法能准确检测出布鲁氏菌,并能对其种、型进行鉴定;PCR-SSCP方法可将A19疫苗株与野毒株区分开来。(2)内参PCR方法在与细菌分离鉴定、血清学诊断的对比中,呈现出较高的阳性符合率(与细菌分离的阳性符合率为100%,与iELISA的阳性符合率为62.5%),其对血样、奶样的检出量分别为35CFU/ml、350CFU/ml,该方法适合于血样、奶样中布鲁氏菌的检测。(3)VirB8-PCR诊断试剂盒在对布鲁氏菌标准株、疫苗株及65份送检血样进行检测中,能从SAT阴性血样中检测出2份阳性,表现其敏感性高于SAT,同时实验数据表明,当每毫升血样中含有布鲁氏菌数量为35时即可被本试剂盒检测出阳性结果,体现出本试剂盒较高的敏感性。实验结果证实:本试剂盒的可重复性良好、特异性高,-20℃下可有效保存至少6个月。