第一部分甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症（cblC型）患儿的随访研究目的:甲基丙二酸血症（MMA）是一种影响异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、胸腺嘧啶和奇数链脂肪酸分解代谢的常染色体隐性遗传病,是由于甲基丙二酰辅酶A变位酶（MCM）缺陷或其辅酶腺苷钴胺素缺陷导致的。细胞内钴胺素代谢缺陷分为9个亚型（cblA-G,J和X）。以cblC型最为常见,其编码基因是MMACHC,定位于1p34.1。MMA的发病率约为1:48,000到1:250,000。现在扩展的新生儿疾病筛查已经包括了MMA。随着新生儿疾病筛查的普及,改善患儿的预后成为可能。我院对MMA的新生儿串联质谱筛查开始于2011年5月。本研究的主要目的是通过新生儿疾病筛查评估2011年5月-2014年5月本地甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症的发病率并总结经早期治疗cblC型患儿的临床表现、生化特征、突变分析、治疗方案和随访信息。方法:自2011年5月-2014年5月,在我院共有35,291名新生儿（包括包括正常新生儿、高危儿、早产儿或低出生体重儿）接受MMA的筛查。利用串联质谱技术检测干燥血片中的丙酰肉碱（C3）、C3/乙酰肉碱C2和蛋氨酸的水平。超过截断值的,原血片复查一次,如仍超出参考范围的即召回复查,复查后对于显著超出截断值且有明确甲基丙二酸血症提示的,确定为筛查阳性病例,进一步做确诊试验。为明确诊断,可疑病例须经气相色谱-质谱检测尿中的有机酸水平。此外,还要检测总的血浆同型半胱氨酸水平、叶酸、维生素B12以排除营养性甲基丙二酸血症。每一例确诊患儿均进行DNA序列分析,取外周血用酚-氯仿法提取基因组DNA,PCR扩增MMACHC进行基因诊断。确诊后采用四种药物联合治疗,即羟钴胺素（1mg,每周2次,肌注）、左旋肉碱（50-100mg/kg/d,口服）、甜菜碱（500-1000mg/d,口服）和亚叶酸钙（10-30mg/d,口服）。在治疗期间,定期监测患儿的MMA、C3、总血浆同型半胱氨酸、蛋氨酸水平和智力发育水平。对于4岁以内的患儿,采用Gesell儿童发育量表对患儿发育商进行评估。结果:1、通过新生儿筛查在35,291名新生儿中确诊了 9例甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症患儿,发病率约为1:3920。2、9例患儿均表现为C3升高（>5 μmol/L）、C3/C2升高（>0.2）及蛋氨酸正常或降低。此外,患儿尿中甲基丙二酸和血浆总半胱氨酸水平也升高。因此,他们最终确诊为甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症。3、9例患儿均为cblC型。为明确是否为cblC型进行MMACHC基因测序,其中,经基因突变分析9名患儿均发现了 MM4CHC突变,共检测出7种突变,即:c.609G>A、c.455-457delCCC、c.394C>T、c.445₄46insA、c.658₆60delAAG、c.452A>G 和IVS1+1G>A。最常见的突变是c.609G>A,其次为c.658₆60delAAG。2名患儿为同源突变,分别是 c.445₄46insA/c.445₄46insA 和 c.609G>A/c.609G>A。经 Mutationtaster软件生物学信息学分析,这些突变均为致病突变。4、明确诊断后其中6名患儿进行肌注维生素B12等治疗,2名患儿未接受治疗,1名患儿出生38天后死于感染引起的代谢性酸中毒。其余患者均存活。5、随访生化结果:治疗后5名患儿生化指标明显改善,表现为尿的甲基丙二酸和血浆总同型半胱氨酸水平降低同时伴有蛋氨酸的升高。6、临床表现与发育评估:经治疗后虽然生化指标有改善,但患儿的临床表现差异较大。该5名患儿均有发育延迟并表现出各种神经损害,例1临床表现为肌张力降低、喂养困难及轻度发育落后,核磁共振显示胼胝体变薄,9个月大时发育商低于75。例2表现为轻度肌张力降低及轻度智力和语言发育落后,其在2岁5个月时发育商低于75。例3患儿由于个人原因转院,因此无法获知该患儿的治疗方案以及其临床表现及发育商值。例4表现为较差的精细动作技巧、智力低下、语言发育落后及视神经萎缩（右眼失明）,核磁共振显示其肼胝体变薄,在2岁3个月时发育商低于75。例5表现为轻度肌张力降低和智力低下,在2岁半时发育商值较低。例6表现为轻度智力低下及中度语言发育落后,在1岁11月时发育商值低于75。例8未接受任何治疗,表现为肌张力降低、昏睡、发育停滞及严重的智力低下,在8个月时发育商值明显低于75。例9也未接受治疗,但此患儿未表现出明显的发育落后,在1岁1个月时其发育商接近正常水平。结论:1、本研究我们总结了通过新生儿筛查诊断的患儿的临床表现、生化参数、基因突变分析、治疗及随访数据。根据这些数据,本地MMA的发病率约为1:3920。美国纽约州通过新生儿筛查评估MMA的发病率约为1:100,000。MMA在意大利的发病率约为1:115,000,德国约为1:169,000,北京和上海约为1:26,000,台湾约为1:85,000,浙江约为1:64708。相比较而言,本地cblC型的发病率要明显高于其他地区。2、本研究中,9 例患儿发现了 7 种突变,即:c.609G>A、c.455-457delCCC、c.394C>T、c.445_<sub>446insA、c.658₆60delAAG、c.452A>G 和 IVS1+1G>A,其中 c.455-457delCCC和IVS1+1G>A是新突变,其余的5种突变均已有报道。c.609G>A的突变频率最高（66.75%）,其次为c.658_<sub>660delAAG（44.4%）。我们的结果和以前类似的研究结果相一致3、我们的研究明确了早期接受治疗的患儿神经发育表型,通过早期的治疗和干预改善了患儿的预后,不过长期疗效并不令人满意。虽然此研究的病例过少,但对明确影响cblC型甲基丙二酸血症患儿预后的基因型-表型关系是有一定价值的。4、本研究中患者的数量过少还不能完全确定基因型-表型的相关性。为了进一步明确基因型-表型的相关性,应进行大的多中心研究。对于不同突变导致临床差异的进一步研究将有助于了解cblC型疾病的发病机制,而且明确MM4CHC突变对蛋白结构和细胞功能的影响也是有必要的。第二部分四氢生物蝶昤缺乏症患儿的随访研究目的:高苯丙氨酸血症是常见的常染色体隐性遗传病,主要是有苯丙氨酸轻化酶或BH4合成或再循环所需的酶缺乏导致。其中,苯丙氨酸羟化酶缺乏最为常见。苯丙氨酸轻化酶缺乏症主要通过限制苯丙氨酸的摄入治疗,早期的饮食限制可有效预防苯丙氨酸轻化酶缺乏引起的发育落后。引起高苯丙氨酸血症少见的原因是苯丙氨酸羟化酶的辅酶（BH4）的缺乏,BH4缺乏导致神经递质合成的减少,所以BH4缺乏的患者只限制饮食来治疗仍会表现出进行性的神经损害,因此,BH4缺乏患者应尽快从高苯丙氨酸血症患者中鉴别出来。BH4缺乏可通过BH4和神经递质（多巴胺和5羟色胺）的联合使用来进行治疗。很多国家已经开展了高苯丙氨酸血症的新生儿筛查。在中国,1981年上海首先开展了高苯丙氨酸血症的新生儿筛查,1990年开始进行BH4缺乏的筛查。本省自2004年开始进行BH4缺乏症的鉴别诊断,本研究就是以自2004-2012年以来我院进行鉴别诊断和治疗的BH4缺乏患者为研究对象,观察患儿的临床表现,治疗后症状的改善情况,并对确诊患儿进行基因检测、突变分析,定期监测患儿的血苯丙氨酸浓度,神经系统症状,以及智力发育评估,并对长期随访的患儿的病例进行总结,并期望降低BH4患儿的神经系统损害,大大提高BH4患儿的预后,达到保证其健康成长的目的。方法:应用高效液相色普法技术对通过新生儿筛查诊断的396例高苯丙氨酸血症患者检测尿中的新蝶呤和生物蝶呤,并进一步做了BH4负荷试验,部分病人进行了基因检测。采用三种药物联合治疗,即BH4（2-10 mg·kg/d）,左旋多巴（5-10 mg/kg/d）和5-羟色胺（3-5 mg/kg/d）。定期监测血中苯丙氨酸浓度、体格发育、智力发育水平及临床表现。对于4岁以内的患儿,采用Gesell儿童发育量表对患儿发育商进行检测。对于4岁以上的患儿,采用Wechsler儿童智力发育量表对IQ进行检测。结果:1、2004年到2012年期间共诊断了40例BH4D患者,都符合PTPS缺乏症。2、这些患者诊断时年龄从20天到41个月,PTPS基因突变分析检测出7种突变:P87S、K91R、T106M、D96N、N52S、S21R和L127F。3、大多数患者接受了BH4、左旋多巴和5-轻色胺的治疗。19例患者按时随访,其中9例患者（7例早期诊断和2例晚期诊断）发育正常,10例患者（8例早期诊断和2例）表现为发育延迟。结论:1、通过新生儿筛查出的所有的高苯丙氨酸血症患者都应进行BH4鉴别诊断。早期的诊断和及时的治疗对患儿的预后是有利的。2、本研究提示新生儿期如能做到早期筛查、早期鉴别诊断BH4缺乏症,以后BH4缺乏导致的神经发育损害发生率将会逐渐减少。3、通过本研究促使政府和大众关注罕见病和孤儿药,促进罕见病患儿医疗保障制度的健全。