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随着对乳品致敏性认识及重视程度的不断加深,脱敏乳制品已成为研究热点,而目前最具前景的制备方法为蛋白酶水解法,该方法在有效降低和消除过敏原蛋白致敏性的同时还可保留乳品原有营养价值成分。因此,筛选获得一个可高效降解过敏原的蛋白酶,可以为脱敏乳制品制备提供关键素材,也可以更好的研究蛋白酶脱敏机理。枯草杆菌蛋白酶因其优良的生产性能,在轻工业行业中有着广泛的应用,但由于其热稳定性较差,需要进一步通过结构改造提高其稳定性以适配于工艺流程。此外,由于其催化口袋结构特殊,具有较广泛的底物选择性,非常适合作为理性设计的出发蛋白酶,以定制催化性能特殊的突变体蛋白酶。蛋白质晶体结构可提供大量的结构数据,获得目标蛋白酶晶体结构可帮助进行理性设计,提高对其的改造成功率。基于此,通过高通量筛选获得一株可高效降解牛奶过敏原β-乳球蛋白的蛋白酶产生菌,研究其关键蛋白酶枯草杆菌蛋白酶E-S7（SES7）的酶学性质、晶体结构及酶的应用性能改造,主要研究结果如下:（1）菌种筛选与蛋白酶鉴定以脱脂奶粉平板水解圈法进行菌株初筛,再以过敏原β-乳球蛋白（BLG）ELISA试剂盒菌株复筛,从16000株野生菌中筛选获得了42株具有较好BLG降解能力的菌株,并通过16S rDNA和功能基因gyrA测序进行菌种鉴定,其中去除过敏原效果最好的为一株枯草芽孢杆菌JN-S7（保藏编号为CCTCC M2016532）。结合肽指纹图谱分析,鉴定目标菌中的关键蛋白酶,枯草杆菌蛋白酶E-S7,并调取其基因序列构建重组表达质粒pET-24a（+）/aprE,并通过初步分离纯化获得重组蛋白酶。该重组蛋白酶的一小时过敏原去除率为99.88%,脱敏效果相比于商品酶A2-SD约高6倍。结合感官评定和高效液相色谱法,分析了枯草杆菌蛋白酶E-S7水解脱脂奶粉后水解产物的口感和其中游离氨基酸的含量,较商业酶性能更佳,有较好的研究价值。（2）蛋白酶酶学性质鉴定及其晶体结构解析在0.15 M硫酸铵,15%（w/v）PEG 4,000,0.1 M Tris-HCl（pH 8.0）的条件下获得了SES7突变体S221C的片状晶体。通过同步辐射光源x射线衍射,获得了分辨率1.90（?）的成熟形式的SES7,PDB编号为6O44。结合此前报道的高度同源的前体形式结构（PDB编号1SCJ）进行分析,发现该结构中非前肽的成熟部分与SES7仅有三个氨基酸不同,并初步了解了其催化口袋的结构和功能之间的关系。为了进一步研究蛋白酶底物选择性的机制,采用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）对蛋白酶水解脱脂奶粉的水解产物进行肽段鉴定,最终获得了水解产物中276个肽段序列,通过统计学分析其C端各个位点氨基酸的出现频率,可以发现该蛋白酶在P2位对脯氨酸的选择较高,该结果与此前获得的蛋白晶体结构分析结果一致。此外,测定了水解产物的ACE抑制剂和NLN抑制剂活性,其半抑制浓度分别为IC50-ACE=67±0.92μg/mL和IC50-NLN=263±13μg/mL。（3）B-FIT策略设计提高蛋白酶热稳定性重新定义了提取每个残基的B因子值的计算方式,以用于更精确的标准化B因子计算。采用了一种全新的生物信息学分析策略,鉴定了蛋白不稳定性相关的关键区域,结合结构功能分析确定了需要进行替换突变的区域Loop 158-162。同时使用更新的标准化B因子算法结合PyMOL脚本,在PDB数据库中筛选出合适的热稳定模体作为替换突变候选序列,总共分析了445个不同蛋白酶的晶体结构,筛选获得了29个热稳定模体序列。以这些序列为起点进行迭代同源建模,并通过分子动力学模拟验证,然后将模拟结果较好的五个突变体进行实验验证。采用差示扫描荧光法（DSF）测定蛋白酶的熔点温度（Tm）,与野生型相比突变体M5的Tm值提高了7.3°C。此后,解析了该突变体的晶体结构,在0.2 M溴化钠,20%（w/v）PEG 3,350的条件下获得了S221C叠加M5突变体的片状晶体。通过同步辐射光源x射线衍射,获得了分辨率1.96（?）,PDB编号为6PAK。结果表明,M5比野生型蛋白形成更多的氢键,这与本研究的设计和分子动力学模拟结果一致,为此而构建的新的B-FIT策略也可应用于其他蛋白质的热稳定性改造设计。（4）理性设计重构蛋白酶底物选择性通过底物口袋电荷分析和底物口袋瓶颈半径分析,并结合迭代同源建模对蛋白酶SES7进行理性设计,重构了底物口袋的电荷分布和空间几何结构,从而使其对带正电荷的侧链残基底物的选择性从21%提高到50%,同时通过双区域替换突变调整S1底物口袋的瓶颈半径（BNR）,发现当BNR为2.53（?）是蛋白酶催化活性最高,且其阈值范围约为2.02–2.58（?）。进一步通过应用效果分析,发现改造后的突变体L1-2&L2-5在高效去除过敏原BLG的同时还可以保留牛奶中的其他营养蛋白。