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背景和目的： 在动脉粥样硬化(AS)的发生、发展过程中，炎症反应具有重要作用，它贯穿于AS病变的各个阶段，同时也将AS病理改变与各种危险因子、临床心血管事件联系在一起。胰岛素抵抗(IR)不仅是AS的等危症，同时也是一种低水平的炎症，高浓度胰岛素(INS)通过激活细胞内信号转导通路，促进细胞增殖或炎性细胞因子表达。诱导型环氧合酶(COX-2)在炎症性疾病中起着重要作用，同时与AS关系密切，可能是防治AS或急性冠脉综合征(ACS)潜在的新靶点。本研究以人的冠脉标本为观察对象，比较了不同类型AS斑块中COX-2的表达，以探讨COX-2与AS病变以及AS斑块稳定性之间的关系；以高浓度INS刺激体外培养的大鼠动脉平滑肌细胞(VSMC)、人内皮细胞(EC)，以COX-2抑制剂(NS-398)进行干预，观察其对INS刺激的影响；在VSMC中，从基因、蛋白、酶活性三个水平观察INS对VSMC表达COX-2的影响．并探讨丝裂酶原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路与INS诱导COX-2的关系；以含人COX-2cDNA的表达载体(pCMV-COX-2)转染内皮细胞(EC)，观察阿司匹林和选择性COX-2抑制剂NS-398对转染后的EC表达细胞间粘附分子(ICMA-1)的影响，从而探讨COX-2抑制剂潜在的抗AS作用。 方法： 1、45个人冠脉标本根据AHA组织学分类定义和HE染色病理特征，以炎细胞含量为标准，分为正常冠脉(无炎细胞)、纤维斑块(轻度炎症、炎细胞<25％)、和复合斑块(炎细胞≧25％)组，复合炎症组中再分为中度炎症组(炎细胞<50％)和重度炎症组(炎细胞≧50％)。分别进行COX-2免疫组化染色，观察COX-2在不同类型AS病变处表达的分布情况，COX-2染色阳性细胞超过50％定为+++，6％—50％为++，5％以下或轻度染色为+，无染色为阴性(一)。 2、原代培养大鼠VSMC、以终浓度分别为10、100、500、1000mU／L的INS，第二军医大学博士毕业论文中文摘要l、5、10、50、100uM的NS一398，以及二者共同刺激细胞24、48、72小时，M竹法检测细胞吸光度反映VSMC增殖情况。2、培养人EC株，终浓度分别为10、100、500、1000mU/L的州S刺激6小时，100mU几的INS刺激l、3、6、12小时，10uM的NS一398与不同浓度的取S共同刺激细胞6小时，Rl’- PCR检测EC中ICAM一1表达。 3、VSMC经INS不同浓度和时间刺激后，R不PCR、W匕stern一blot检测取S诱导COX一2的时效性和量效性，EIA检测VSMC合成的PGE:代表COX一2活性;W匕stem一blot检测阿司匹林和NS一398对COX一2蛋白表达的影响;以PD98059(P42/4 4MAPK抑制剂)和SBZo358o(p38MApK抑制剂)以及磷酸化JNK抗体、检测INS诱导COX一2的细胞内信号转导通路。 4、pCMV-C0x一2扩增和酶切鉴定后，通过脂质体(Lipofectin)转染人Ec，RpPCR和W七stem一blot检测目的基因和蛋白表达;Rl’- PCR检测转染后引起的ICAM一l表达、以及阿司匹林和NS一398的影响。结果: 1、COX一2主要在AS斑块处表达，正常冠脉未见COX一2表达，纤维斑块组COX一2表达为(一~+)，中度炎症组为(+一++)，重度炎症组为(++一+++)，COX一2在正常冠脉、纤维斑块、复合斑块中的阳性率分别是0、22.7%、100%，COX一2的表达量在复合斑块中明显高于纤维斑块，重度炎症组中明显高于中度炎症组，并与斑块炎症程度显著相关(p二0.000，尸0.887)o 2、随着州S作用时间和浓度的增加，VSMC增殖明显增加，呈时效和量效关系(0.000轰p委0.041，0.4ox丢r聋0.760)。NS一398对VsMC的增殖无明显影响(P>0.05)，但可以抑制INs引起的vsMC增殖。INs刺激Ec可引起IcAM一1 mRNA表达，而且IcAM一1表达随INS作用时间和浓度而增加(p<0.01)。Ns一395与取S共同刺激后，EC表达ICAM一无明显变化(p>0.05)。 3、10、100、500、1000mU/L的取S分别刺激VSMC3、6、12、24小时后，可诱导COX一2的基因和蛋白表达、并刺激VSMC合成PGEZ、均表现出时效和量效关系(p<0.01);阿司匹林(100林M和400林M)和NS一398(10林M和100林M)对COX一2蛋白表达无明显影响(P>0.05);pD98059(25林M)、SB203580(20林M)、以及二者共同作用均使INs诱导的cOX一2蛋白表达明显减少(p<0.01);INS刺第二军医大学博士毕业论文中文摘妥激后引起活化的JNK蛋白表达，其时间窗口为15一120分钟。 4、pCMV-COX一2经脂质体转染后，EC在基因和蛋白水平均可表达COX一2;转染后的EC表达ICAM一l明显增加(p<0 .01)，阿司匹林(100林M和400林M)和Ns一398(10卜M和10即M)可以降低ICAM一l表达，NS一398的作用强于阿司匹林(p<0.05)。结论: 1、高浓度INS通过激活细胞内MAPK信号通路刺激COX一2表达、进而产生促AS作用。 2、COX一2参与了AS病理发生以及斑块易损化中的炎症反应过程，有望成为抗AS、特别是稳定斑块治疗的新靶点。 3、选择性COX一2抑制剂能够降低炎症反应、对防治AS和急性冠脉事件具有潜在的应用价值。