【背景】2019年12月,由新型冠状病毒（SARS-Co V-2）感染引起的新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019,COVID-19）在世界范围内流行,截至2021年3月19日,全球已有121,474,329例确诊病例,累计死亡病例达2,684,173例。COVID-19的大流行给全球人民的身心健康、社会的稳定发展带来了巨大的损害,因此科学高效的防控策略、快速准确的诊断方法、精准无误的治疗方案和安全有效的预防疫苗是阻止新冠肺炎疫情继续蔓延的关键。本研究旨在对COVID-19无症状感染者、不同严重程度和不同临床结局的COVID-19患者体内的特异性抗体进行系统性研究,全面阐明SARS-Co V-2感染后机体的体液免疫应答规律。这对于理解SARS-Co V-2感染与宿主的免疫反应具有重要意义,对COVID-19感染的诊断、治疗和疫苗研发具有重要指导意义。【方法】1.利用SARS-Co V-2蛋白质芯片,检测783例COVID-19患者的2360个血清样本和601例对照血清样本中针对SARS-Co V-2的20种蛋白的特异性抗体,从而全面构建针对20种蛋白抗体反应的全景图。同时,结合临床病例信息,分析不同严重程度和临床结局（非重症、重症-出院和重症-死亡）的患者血清中特异性抗体的水平以及随发病时间的动态变化规律,从而理解COVID-19患者体内SARS-Co V-2特异性抗体在疾病进展中的作用。2.从同济医院在疫情流行期间住院收治的1056例COVID-19患者中,采用随机抽样获得123例不同严重程度和临床结局（轻型/普通型、重型、危重型-出院和危重型-死亡）的COVID-19住院患者,通过假型病毒中和抗体测定法检测血清中的中和抗体水平,并将其与疾病的发生发展时间、严重程度、临床治疗方案、重症化的实验室检测指标和临床结局等进一步进行关联分析,全面了解疾病进展过程中的中和抗体的动力学及其临床意义。3.利用SARS-Co V-2蛋白质芯片,检测1034例COVID-19患者2977个血清样本中20种SARS-Co V-2蛋白特异性抗体水平。使用Cox比例风险模型、Kaplan-Meier生存分析探索患者入院时血清中SARS-Co V-2特异性抗体与临床结局之间的关联。同时进一步分析不同严重程度和临床结局（非重症、重症-出院和重症-死亡）的患者在入院时血清中特异性抗体的水平以及随发病时间的动态变化规律。通过计算交叉验证模型验证这10种抗体的预测能力。4.通过SARS-Co V-2核酸检测和抗体检测筛查11,766名流行病学疑似个体,包括确诊病例的密切接触者、聚集性疫情接触者、流行病学追踪和复工返岗人员,筛选出核酸或抗体阳性的无症状感染者,同时纳入63名健康人和51例轻症患者作为对照。利用SARS-Co V-2蛋白质芯片和假病毒中和抗体测定法,检测研究对象血清中20种SARS-Co V-2蛋白特异性抗体以及中和抗体的水平,分析比较无症状感染者和轻症患者体内特异性抗体和中和抗体的水平,以及随暴露（或发病）时间的动态变化规律。【结果】1.构建COVID-19患者血清针对SARS-Co V-2蛋白组特异性抗体反应的全景图（1）S和N蛋白诱导产生最强的抗体反应,并在不同严重程度和临床结局的患者体内呈现不同的动态变化规律。非重症患者在发病后S1 Ig G逐渐上升,到25天左右达到稳定,并维持至60天,重症-出院患者在发病后,S1 Ig G快速上升,在25天左右达到峰值,之后便开始缓慢下降,而重症-死亡患者,S1 Ig G同样快速上升,在25天左右达到峰值,但之后便迅速下降。（2）另外,非结构蛋白和辅助蛋白（NSP1、NSP7、NSP8、Rd Rp、ORF3b和ORF9b）也引起Ig G反应。但非结构/辅助蛋白的Ig G反应和动态变化不同于S和N蛋白。非结构/辅助蛋白的Ig G反应与疾病的严重程度和临床结局相关。在症状发作后约20天,非重症、重症-出院和重症-死亡患者体内非结构/辅助蛋白特异性Ig G抗体水平均急剧下降。2.建立了COVID-19患者血清中和抗体的动力学（1）不同严重程度和临床结局的患者血清中和抗体水平和动态变化规律是不同的。在抗体产生的上升期,轻型/普通型患者的中和抗体产生速率明显低于其他组患者。在稳定期,重型和危重型患者的中和抗体水平均高于轻型/普通型患者。在衰退期,危重型-死亡患者的中和抗体水平在四组患者中的下降速率最快,而轻型/普通型患者的中和抗体的下降速率最低。危重型-出院和重型患者的中和抗体缓慢下降至与轻型/普通型患者同一水平,并且这三组的中和抗体可能会维持更长的时间。（2）建立了中和抗体和疾病进展的关联。轻型/普通型患者无需任何氧疗措施,疾病可以快速恢复。其外周血淋巴细胞数量正常,体内无炎症因子风暴以及炎症反应,血清中和抗体水平维持在较高水平。重型患者在面罩吸氧或鼻吸氧的辅助治疗下,疾病逐渐恢复。其仅在急性期外周血淋巴细胞数量低于正常水平,中和抗体逐渐下降但维持在中高水平。危重症患者通常出现严重的呼吸困难,外周血淋巴细胞数量显著下降,IL-6、CRP和D-二聚体等指标显著上升。在机械通气的辅助治疗下,危重型-出院患者疾病逐渐恢复,中和抗体维持在中高水平。而危重型-死亡患者即使采用机械通气甚至ECMO支持治疗,仍无法阻止疾病进展,淋巴细胞进行性下降至极低水平,CRP维持高水平,IL-6进行性上升。因而,血清中中和抗体急剧下降,疾病最终恶化。以上结果表明中和抗体对疾病的恢复起着至关重要的作用,稳定的中和抗体水平可以避免疾病加重或死亡。3.建立依据早期的Ig G抗体反应预测COVID-19患者临床结局的方法（1）全面分析了COVID-19患者血清中SARS-CoV-2特异性IgG抗体与临床结局的关联。Cox比例风险模型发现COVID-19患者入院时血清中非结构/辅助蛋白（NSP1、NSP4、NSP7、NSP8、NSP9、NSP10、Rd Rp、NSP14、ORF3b和ORF9b）特异性Ig G抗体与COVID-19死亡风险存在显著正相关,Kaplan-Meier生存分析和主成分分析进一步证实了该结论。（2）此外,患者入院后血清中这些非结构/辅助蛋白特异性Ig G抗体的水平与疾病的严重程度有关,重症-死亡患者血清中非结构/辅助蛋白特异性Ig G抗体水平比重症-出院患者和非重症患者高。动态变化规律也显示早期重症-死亡患者血清中非结构/辅助蛋白特异性Ig G抗体水平均比重症-出院患者和非重症患者高。（3）通过计算交叉验证模型得出这10种抗体预测COVID-19死亡的AUC在0.62-0.71之间。结果表明早期高水平的非结构/辅助蛋白（NSP1、NSP4、NSP7、NSP8、NSP9、NSP10、Rd Rp、NSP14、ORF3b和ORF9b）特异性Ig G抗体水平会增加COVID-19的死亡风险并且可以作为COVID-19死亡预测的潜在指标。4.COVID-19无症状感染的诊断和抗体产生规律（1）通过核酸检测筛查了11,766名流行病学疑似个体,发现有12名无症状感染者（核酸检测阳性但无任何临床症状以及肺部影像学表现）。同时采用SARS-Co V-2抗体检测法对所有对象进行血清学调查,发现了另外51例无症状感染者（血清Ig G或Ig M阳性但无任何临床症状以及肺部影像学表现）。将这63例定义为无症状感染者。同时在核酸和抗体均阴性的11,703人中筛选无临床症状、肺部无影像学表现、无合并症以及年龄性别与无症状感染者匹配的63名健康人作为阴性对照。另外,从1056例在同济医院住院的COVID-19患者中筛选出51例无合并症、肺部无影像学表现,仅有轻微临床症状的的轻症患者作为阳性对照。（2）根据核酸检测和血清学检测的结果将无症状感染者和轻症患者进行分组,63例无症状感染者可以被分为四个亚组,81%（51/63）的无症状感染者核酸检测为阴性,19%（12/63）的无症状感染者核酸检测为阳性,而核酸检测阴性Ig M阳性的有36.5%（23/63）,如果联合核酸检测和Ig M的结果可将无症状感染者检出的灵敏度从19%提高到55.5%（35/63）。结果表明核酸检测联合血清学检测可显著提高无症状感染者检出的灵敏度。（3）与健康对照组比,无症状感染者和轻症患者均诱导产生更强的Ig M和Ig G反应,尤其是S1和N蛋白特异性抗体反应。尽管通过聚类分析发现无症状感染者和轻症患者具有相似的Ig M抗体表达谱,但轻症患者血清中S1和N蛋白特异性Ig M抗体水平高于无症状感染者。另外,与无症状感染者相比,轻症患者诱导产生更强的S1和N蛋白特异性Ig G反应。（4）无症状感染者在暴露后的第7天,体内就产生S1和N特异性IgM和IgG反应,并在第17天到25天达到峰值,然后开始下降。S1 Ig M在暴露后2个月下降至无法检出的水平。轻症患者在发病后第一天,体内迅速产生N蛋白特异性Ig M并维持高水平,而S1特异性Ig M则持续增加直至发病后的第29天。此外,轻症患者的S1和N特异性Ig M和Ig G反应至少维持到第65天。（5）有38.1%（24/63）无症状感染者体内未产生中和抗体,61.9%（39/63）的无症状感染者仅产生低滴度的中和抗体,轻症患者产生的中和抗体水平高于无症状感染者。另外,无症状感染者在暴露后第7天,体内迅速产生中和抗体,并在10天到25天达到峰值,然后迅速衰减。而轻症患者在发病后第1天,体内就产生了较低水平的中和抗体,然后滴度持续上升直至22天,并维持高水平至第65天。结果提示无症状感染者也需疫苗免疫。【结论】我们的研究阐明了机体针对SARS-Co V-2的体液免疫应答的全面规律,这对COVID-19的研发早期诊断技术、早期预测患者预后、改善临床管理、指导恢复期血清治疗和疫苗研发,以及制订有效的疫情防控策略等具有重要意义。