单核细胞增生李斯特菌(简称单增李斯特菌,Listeria monocytogenes)为革兰氏阳性无芽孢杆菌,对环境耐受性强,可以在宽泛的pH(4.5-9)和温度(0-45℃)以及高盐(10%NaCl)条件存活并增殖。该菌是一种重要的食源性人畜共患病原菌,引起败血症、脑膜炎、孕妇流产等,病死率高达30%。单增李斯特菌可以分为四个谱系,绝大部分李斯特菌病由谱系Ⅰ和Ⅰ菌株引起；谱系Ⅲ和Ⅳ菌株很少引起人发病,但他们的致病力差异很大,表明它们仍有引发李斯特菌病的风险。单增李斯特菌有一套完整的毒力因子参与胞内感染过程,包括InlA和InlB等内化素在特异性受体介导下入侵宿主细胞,LLO、PlcA和PlcB等膜裂解因子裂解吞噬体膜,进入胞浆后由ActA募集宿主细胞肌动蛋白向邻近细胞迁移,进入次级感染的细胞内开始新的感染周期。参与这一感染过程的主要毒力因子均受PrfA正调控。然而,本实验室已有的2株同为谱系Ⅲ菌株对小鼠的致病力差异显著,而且两者受PrfA调控的毒力因子表达水平也有明显差异。此外,单增李斯特菌拥有多套抗酸应激系统,它们均能独立发挥抗酸应激作用。已有研究表明,对单增李斯特菌抗酸应激贡献最大的是谷氨酸脱羧酶(GAD)系统,该系统由三个谷氨酸脱羧酶和两个谷氨酸逆向转运因子组成,但目前关于GAD系统各组分的作用及其抗酸应激调控未见研究。本研究旨在：(1)通过比较基因组学分析单增李斯特菌谱系Ⅲ强毒与弱毒株致病力差异的分子基础；(2)探明活化型PrfA以及受其调控蛋白与单增李斯特菌谱系Ⅲ强毒和弱毒株致病表型差异的关系；(3)解明单增李斯特菌GAD系统各组分作用差异的基础及其调控。1.单增李斯特菌谱系Ⅲ强毒株与弱毒株比较基因组学分析单增李斯特菌谱系Ⅲ弱毒株M7和澳大利亚谱系Ⅲ临床分离株Lm850658具有相同的生化反应特性、毒力基因组成以及极近的亲缘关系,但二者致病表型差异显著。尽管M7具有强溶脂和溶血活性,但Lm850658的粘附和侵袭能力、细胞间迁移能力以及对小鼠的致病力均显著强于M7。基因组比较发现,Lm850658和M7基因组大小分别为2,918,502 bp和2,976,163 bp,分别编码2885和2977个基因。Lm850658和M7共有2,761个基因的序列完全相同,另有6个基因内部缺失和66个基因由SNP导致非同义突变。此外,Lm850658和M7分别有33和130个特异基因。Lm850658特异的基因由一个编码23个基因的20,099bp(命名为20K)区域和10个噬菌体相关基因组成；而M7的特异基因则主要由两个前噬菌体区域组成,其中38,450 bp(命名为38K)的前噬菌体编码52个基因,而43,923bp(命名为44K)的前噬菌体编码69个基因。其中Lm850658特异的20K区域为李斯特中首次发现,在NCBI上无同源序列；而弱毒株特异的38K和44K则保守存在于M7、HCC23和L99基因组。通过同源重组技术敲除Lm850658的20K区域和M7的38K区域,虽然20K中有疑似分泌系统蛋白VirB4,38K中有编码穿孔素和裂解素基因,但它们的缺失均不影响相应菌株的粘附和侵袭能力、胞间迁移能力以及小鼠致病力。上述结果表明单增李斯特菌M7和Lm850658致病力差异并非由它们的前噬菌体编码的特异基因所致,而是由其它因子决定。2.活化型PrfA对单增李斯特菌谱系Ⅲ强毒株与弱毒株致病性相关表型的影响单增李斯特菌毒力因子调控蛋白PrfA氨基酸位点突变(如L140F、G145S和G155S)可致其组成性活化。测序结果显示弱毒株M7的prfA与Lm850658和EGDe的存在差异,M7的PrfA为组成性活化型(PrfA145S)。在BHI培养基或全血,M7中受PrfA调控的毒力基因转录水平显著高于Lm850658和EGDe。将Lm850658和M7的prfA相互置换后。对于强毒株Lm850658, PrfA活化可以显著增强其溶血和溶脂活性、细胞毒性以及对Caco-2和HepG2细胞的粘附和侵袭能力,而对于弱毒株M7, PrfA置换成非活化型后对细胞的粘附和侵袭能力则低于亲本株;PrfA活化与否并不显著性影响强毒和弱毒株本身的胞间迁移能力和胞内存活能力；PrfA活化可以显著增强Lm850658对免疫抑制ICR小鼠的致病力。我们进一步通过免疫印迹比较prfA突变株全菌蛋白中PrfA调控的毒力因子表达水平,无论是强毒株还是弱毒株,活化型PrfA均能导致相关毒力因子的高表达。但是分别提取细菌表面结合蛋白和培养上清的分析结果显示,弱毒株M7的InlB在细菌表面的丰度显著低于PrfA活化型的Lm850658；而在培养上清中的结果正好相反,野生型M7的InlB则显著高于PrfA活化型的Lm850658。ActA、LLO和InlA在强毒和弱毒株表面和上清中的分布并无显著性差异。上述结果表明,菌株M7的InlB(李斯特菌黏附与侵袭的主要蛋白)不能有效锚定在细菌表面可能是其黏附和侵袭力低的主要原因之一；虽然ActA在菌体表面的结合程度没有发生改变,但其锚定方式可能不同于强毒株,进而导致细胞间迁移能力下降和液体培养基中聚集性降低；这些主要毒力因子在菌体表面锚定异常可能是M7菌株致病力显著降低的主要因素。由于ActA等蛋白的氨基酸序列在M7和Lm850658之间没有差异,我们推测这种锚定异常可能与M7菌体细胞壁结构差异有关,ActA等蛋白是通过其GW基序与磷壁酸(lipoteichoic acid)的结合锚定在菌体表面的。因此,从细胞壁结构及其与黏附和侵袭相关毒力因子在菌体表面的结合能力作为切入点,深入探索磷壁酸等细胞壁结构相关分子的代谢及其与InlB等蛋白锚定的关系,可能解开类似M7等菌株的弱毒机制。3.单增李斯特菌GAD系统各组分作用比较及其调控单增李斯特菌10403S的抗酸应激能力最强,其次依次是Lm850658、M7和EGDe。比较基因组分析发现FoF1-ATPase系统保守存在于四个菌株中；10403S和EGDe拥有完整的ADI、AgDI以及GAD系统；而Lm850658和M7则缺失AgDI和gadDl/gadTl。在10403S中,gadD2对抗酸应激贡献最大,某次依次为sigB、gadD3、aguAl和arcA,而aguA2和gadDl基本不贡献抗酸应激作用。转录水平分析显示,gadT2/gadD2在10403S中的转录水平最高,gadD3次之,gadD1/gadTl最低。分析不同菌株GAD系统的转录水平发现,10403S的gadT2/gadD2转录水平显著高于EGDe,但它们的gadDl/gadTl和gadD3的转水平相当；M7和Lm850658的gadD2转录水平与10403S相当,但其gadT2显著低于10403S。免疫印迹显示,除了EGDe未检测到GadD2的表达外,其余各菌株的GadD2相对表达量相当,且GadD2的表达量显著高于GadD3。上述结果表明,GAD系统不同组分菌均具有抗酸应激作用,但其抗酸应激贡献大小可能与其表达量正相关；尤其是GadT2/GadD2的表达量是决定不同菌株抗酸应激能力差异的主要因素。分析不同菌株GAD系统各基因的启动子序列发现,10403S和EGDe之间的gadTl1、gadT2和gadD3的启动子序列高度保守,但gfp报告基因分析结果显示,仅PgadT2和PgadD3能启动gfp的表达,而且在不同菌株中启动子活性各异：PgadT2在10403S和Lm850658中的活性最强,在M7中较弱,在EGDe中无活性；PgadD3在10403S和EGDe中的活性相当,但显著低于PgadT2,PgadD3-gfP在Lm850658和M7中不表达。上述结果表明,不同菌株间抗酸能力差异与GadT2/GadD2的表达量有关,其表达量的差异可能受某个转录因子调控。然而,通过表达水平和报告基因分析发现GAD系统并不响应酸应激；除gadD3受应激调控因子SigB正调控外,gadTl和gadT2lgadD2均不受SigB调控；此外,GAD系统亦不受五个疑似GAD转录活化因子GadRs的调控。有趣的是,在pH为8.8的弱碱应激条件下,gadT2/gadD2的转录水平和PgadT2报告基因表达水平显著下调。因此,决定GAD系统抗酸应激主要蛋白GadD2/GaDT2菌株间表达能力差异及其在碱性应激条件下的转录调控因子还有待进一步研究。综上所述,本研究证明了整合在基因组特定位置的三个前噬菌体只贡献李斯特菌的多样性,对致病力无影响；初步阐明了InlB等毒力因子在菌体表面的锚定异常是单增李斯特菌谱系Ⅲ菌株M7弱毒的主要因素；探明了GAD系统中GadD2/GaDT2菌株间表达量差异决定抗酸能力。研究结果为深入探索单增李斯特菌的致病和抗应激机制提供了基础。