日本看麦娘(Alopecurus japonicus)是我国长江流域油菜田主要禾本科杂草,发生广泛,危害严重,严重影响油菜的产量。高效氟吡甲禾灵(Haloxyfop-P-methyl)是芳氧苯氧基丙酸酯类(Aryloxyphenoxypropionate,简称AOPP)除草剂的主要品种之一,其作用机理是抑制禾本科植物体内乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl coenzyme A carboxylase,简称ACCase)的活性,进而影响植物体内正常的脂肪酸合成。作为一种高效除草剂,该药剂被广泛应用于油菜田防除日本看麦娘等禾本科杂草。高效氟吡甲禾灵在油菜田的长期单一使用导致日本看麦娘对其产生抗性。本研究室的前期研究发现了对高效氟吡甲禾灵产生抗药性的日本看麦娘生物型,并最早报道了其抗性水平和交互抗性等相关内容。在此基础上,本文进一步从靶标酶和代谢酶两个方面对其抗性机理进行了深入的研究。本文选取本研究室已报道的江苏句容油菜田抗性日本看麦娘和江苏南京中山陵景区日本看麦娘为研究对象,研究其靶标酶活性、靶标酶基因序列、靶标酶基因表达量、代谢酶活性及代谢酶基因表达量,以期发现它们在日本看麦娘对高效氟吡甲禾灵抗药性中的作用。靶标酶活性研究结果表明：在未接受药剂处理时,敏感日本看麦娘ACCase活性显著高于抗性生物型；在不同浓度高效氟吡甲禾灵酸作用下,抗性和敏感生物型的ACCase活性表现出不同的变化,在高效氟吡甲禾灵酸浓度小于0.1μmol·L-1时,敏感生物型ACCase活性显著高于抗性生物型,当高效氟吡甲禾灵浓度酸大于0.1μmol·L-1时,抗性生物型ACCase活性显著高于敏感生物型。从两生物型ACCase活性随抑制剂浓度变化趋势分析,发现敏感生物型ACCase活性随着高效氟吡甲禾灵酸浓度的升高而下降,下降明显；抗性生物型ACCase活性随着高效氟吡甲禾灵酸浓度的升高也呈下降趋势,较敏感生物型下降幅度小。敏感生物型靶标酶活性的抑制中浓度IC50值为0.0026μmol·L-1而抗性生物型靶标酶活性的IC50值为0.028μmol·L-1抗性生物型ACCase的IC50是敏感生物型的10.78倍。靶标酶基因序列分析表明：日本看麦娘ACCase基因DNA序列长度12151bp,对应的cDNA序列长度为7589bp,其中开放阅读框(Open reading frame, ORF)6960bp,编码2320个氨基酸。通过对比发现,抗性和敏感生物型的DNA序列存在11处差异,cDNA序列存在8处差异,所编码的氨基酸序列存在4处差异。抗性生物型与敏感生物型的ACCase氨基酸序列比对,发生突变的位点及其突变类型分别为1734位精氨酸被甘氨酸取代,1738位甲硫氨酸被亮氨酸取代,1739位苏氨酸被丝氨酸取代,2041位异亮氨酸被天冬酰胺取代。其中第2041位异亮氨酸突变为天冬酰胺在抗性鼠尾看麦娘(Alopecurus myosuroides)和抗性瑞士黑麦草(Lolium rigidum)中已有报道。同时,本研究发现由氨基酸2041位点突变导致的抗性生物型对CHD类除草剂无交互抗性,与前人报道相符。本文推断2041位异亮氨酸突变为天冬酰胺是导致日本看麦娘对高效氟吡甲禾灵产生抗药性的机理之一。其他三个位点突变是否与抗性相关,有待于进一步研究。靶标酶基因表达量的研究结果显示：抗性和敏感日本看麦娘ACCase基因表达量无显著差异,由此推测,抗性日本看麦娘在靶标酶基因表达水平上无显著改变。代谢酶含量及活性研究表明：药剂处理前后,抗性和敏感日本看麦娘植株细胞色素P450含量变化表现出不同的趋势,随药剂处理时间的延长,敏感生物型的细胞色素P450含量呈先上升后下降的趋势,变化缓慢,抗性生物型细胞色素P450含量变化表现相同的趋势,但变化幅度更明显,同时,抗性生物型细胞色素P450含量的最大值显著大于敏感生物型；细胞色素b5的含量变化趋势与细胞色素P450基本吻合；NADPH-P450还原酶活性随药剂处理时间的变化趋势与细胞色素P450含量变化趋势也基本吻合,但抗性和敏感生物型NADPH-P450还原酶活性始终无显著差异。谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferases, GST)比活性研究结果显示：药剂处理前,抗性生物型GST比活性显著高于敏感生物型,药剂处理后,随着时间的延长,抗性生物型GST比活性呈先下降后上升趋势,而敏感生物型GST比活性呈持续下降趋势,变化缓慢,在整个处理时间内抗性生物型GST比活性始终高于敏感生物型。代谢酶基因表达量结果显示：抗性和敏感日本看麦娘CYP71C6vl基因表达量无显著差异。同时,GST基因表达量亦无显著差异。由此推测,抗性日本看麦娘的代谢酶基因表达水平也无显著变化。综上所述,句容油菜田日本看麦娘对高效氟吡甲禾灵的抗性机理主要作用是靶标酶抗性机理,同时,代谢酶代谢能力的增强提高了其抗性水平。