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大肠杆菌是生产治疗性药物蛋白的主要宿主之一,与哺乳动物细胞表达系统相比具有生产周期短、成本低等优点,但其应用范围仍有局限。主要有两方面问题:一是天然大肠杆菌缺乏蛋白质翻译后加工功能,不能表达糖基化修饰的重组蛋白质。虽然应用空肠弯曲杆菌的寡糖转移酶（pglB）能够在大肠杆菌的质周腔内实现N-糖基化重组蛋白表达,其N-糖链包括空肠弯曲杆菌的七糖及人源核心五糖（Man3GlcNAc2）等,但是这些糖链结构和人源糖链的结构相差仍很大并且修饰效率较低。二是末端连接唾液酸的N-糖基化是人源糖蛋白中常见的修饰,但大肠杆菌工程菌株缺乏唾液酸的从头合成途径,因此目前尚不能经济、高效地表达唾液酸修饰的重组蛋白。针对以上问题,本文在大肠杆菌中构建唾液酸合成与类人源糖链N-糖基化修饰重组蛋白的新途径,获得高效、低成本制备类人源化N-糖基化蛋白的工程菌株。主要研究内容如下:（1）大肠杆菌N-糖基化途径的受体蛋白模型建立:以人纤连蛋白Ⅲ型结构域10th蛋白（fibronectin type III,FN3）为模式分子,构建了系列含有不同糖基化识别位点的受体蛋白表达载体,并分别与携带空肠弯曲杆菌N-糖基化基因簇的pACYCpgl载体（可合成七糖链 GalNAc-α-1,4-GalNAc-α-1,4-[Glc-β-1,3-]GalNAc-α-1,4-GalNAc-α-1,4-GalNAc-α-1,3-Bac-）共转入大肠杆菌CLM37进行表达及糖基化效率优化。结果显示自动诱导方法能大幅度提高糖基化效率:将糖基化识别位点天冬氨酸-谷氨酰胺-天冬酰胺-丙氨酸-苏氨酸（DQNAT）构建在受体蛋白FN3-Gly-1（简称FN3-Gly,“Gly”为糖基化识别位点）的C端柔链区时,在优化的自动诱导条件下糖基化效率可达到100%,为构建类人源化N-糖基化修饰蛋白新途径提供了高效的受体蛋白模型。（2）建立大肠杆菌末端唾液酸修饰的类人源化N-糖基化重组蛋白途径,并优化了 N-糖基化修饰效率。1)类人源糖链合成途径建立:构建了类人源糖链合成所需酶基因的载体p15-Ara-lsg（携带大肠杆菌O-特异多糖合成起始酶基因WecA、空肠弯曲杆菌寡糖转移酶基因pglB、翻转酶基因pglK及流感嗜血杆菌脂寡糖基因簇lsgCDEF）,在CLM37体内合成了类人源糖链Gal-β-1,4-GlcNAc-β-1,3-Gal-β-1,3-GlcNAc-;并通过组合不同类型启动子、不同诱导方式及培养条件等优化糖基化修饰重组蛋白的效率,采用阿拉伯糖（Ara）启动子调控类人源糖链合成时N-糖基化修饰效率可达到100%。2)唾液酸合成、转移及蛋白修饰途径建立:构建了 pIG6-Sia-FN3-Gly-P2-plst6载体（携带合成CMP-Neu5Ac的neuBCA基因簇,FN3-Gly基因,组成型P2启动子及α-2,6-唾液酸转移酶基因plst6）,与p15-Ara-lsg载体在敲除nanKETA基因簇的CLM37ΔnanKETA中共表达,组成了唾液酸化类人源糖链（Neu5Ac-α-2,6-Gal-β-1,4-GlcNAc-β-1,3-Gal-β-1,3-GlcNAc-）N-糖基化修饰重组蛋白途径。在优化的自动诱导条件下成功表达了唾液酸修饰的类人源化N-糖基化蛋白FN3-Sia,唾液酸化效率60-70%。（3）建立大肠杆菌胞外分泌表达末端唾液酸修饰的类人源化N-糖基化重组蛋白系统,提高了重组糖蛋白的表达量。1)胞外分泌表达模型建立:敲除大肠杆菌外膜脂蛋白lpp基因,构建渗漏菌株CLM37Δlpp。检测不同分子量的重组蛋白FN3-Gly（14.2 kDa）,增强型绿色荧光蛋白（eGFP-Gly,29.4kDa）和抗 VEGFR3 单链抗体（scFv-vEGFR3-Gly,39.8kDa）表达情况,发现随着N-糖基化蛋白分子量增加,泄漏到培养基部分逐渐降低。在优化的自动诱导条件下N-糖基化FN3-Gly表达量可达到106±7.4 mg/L。2)分泌表达模型的应用:构建系列具有N-糖基化修饰位点的单体拟抗体（Monobody）药物蛋白表达载体,检测N-糖基化抗VEGFR2单体拟抗体FN3VEGFR2-Gly（简称C7+-Gly）分泌表达情况。进一步在CLM37Δlpp中表达类人源糖链（Gal-β-1,4-GlcNAc-β-1,3-Gal-β-1,3-GlcNAc-）N-糖基化修饰的单体拟抗体 FN3VEGFR2-lsg。优化后糖基化效率可达到100%,并达到了较高的表达量（50±3.7 mg/L）。3)唾液酸修饰的类人源化N-糖基化蛋白分泌表达系统建立:构建了 pIG6-Sia-FN3VEGFR2-Gly-P2-plst6 载体（携带neuBCA基因簇,FN3VEGFR2-Gly基因,P2 启动子及α-2,6-唾液酸转移酶基因plst6）,与（2）构建的p15-Ara-lsg载体,共同构成分泌表达唾液酸化类人源糖N-糖基化修饰单体拟抗体研究体系。在CLM37ΔlppΔnanKETA中分泌表达出唾液酸化类人源寡糖链N-糖基化修饰的FN3vEGFR2-Sia,唾液酸修饰效率达到70%,表达量达到40±4.3 mg/L。（4）唾液酸化类人源糖链N-糖基化修饰单体拟抗体的生物物理性质及生物活性。通过对唾液酸化类人源糖链N-糖基化修饰单体拟抗体的性质及活性分析,表明类人源寡糖链N-糖基化修饰FN3VEGFR2-Sia可溶性、化学稳定性、热稳定性及血清稳定性都提高,生物学活性及亲和力没有变化。综上所述,本文在大肠杆菌中构建了高效的类人源化N-糖基化修饰重组蛋白的新途径,通过联合应用敲除外膜脂蛋白的菌株及自动诱导方法大幅度提高了外源重组糖蛋白的表达量及N-糖基化效率,改善了唾液酸化类人源糖链N-糖基化修饰单体拟抗体的生物物理性质,为高效、低成本地制备重组药物糖蛋白提供了新思路,具有理论意义和潜在的应用价值。