论文部分内容阅读
研究背景糖尿病性白内障(diabetic cataract,DC)是糖尿病病人中发生较早的眼部并发症,是致盲的主要原因之一。糖尿病患者的年龄相关性白内障具有发病年龄早、晶状体混浊进展快以及容易成熟的特点。手术是白内障有效的治疗方式,尽管当前手术设备和技术都有很大的发展和提高,但糖尿病患者的手术并发症的发生率较高。随着糖尿病发病率不断增加,DC引起越来越多的重视,但其发病机制尚不明确。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮细胞失去其正常分化表型,转化成为间质细胞的过程。目前研究认为,晶状体上皮细胞发生EMT和白内障的发病关系密切。自噬(autophagy)是细胞清除自身异常蛋白质和细胞器,以及回收利用营养物质的重要途径,对于维持细胞生存和发育极为重要。晶状体上皮细胞通过自噬-溶酶体途径可以清除细胞内累积的晶体蛋白和分化过程中的细胞器,维持细胞的正常形态和分化功能,这也是维持晶状体透明的重要手段。研究发现,自噬功能异常参与了多种白内障的发病过程。microRNAs(miRNAs)是一类内源性的非编码小RNAs,长度约22个核苷酸。miRNAs通过转录后水平调控靶基因的方式,在多个组织内对EMT和自噬相关通路发挥重要作用。因此,miRNAs对EMT和自噬的调控作用成为研究的新视角,同时miRNAs也成为治疗EMT和自噬失调疾病的潜在分子。研究发现,miRNAs与糖尿病性角膜病、原发性闭角型青光眼、视网膜疾病及白内障等眼部疾病的发生关系密切。但是,miRNAs在糖尿病性白内障中对EMT和自噬的调控机制尚无报道。通过miRNA芯片技术(miRNA microarray)可以筛选出正常晶状体和DC组织间差异表达的miRNAs,并对异常表达的miRNAs进行生物信息学预测和功能研究,有助于发现DC的发病机制。研究目的本研究运用DC晶状体上皮细胞的miRNAs表达谱和体外高糖模型,研究miR-30a对晶状体上皮细胞的EMT和自噬的调控机制,探讨其在DC发病过程中的作用。研究方法1.利用miRNA芯片技术,建立正常晶状体和DC晶状体上皮细胞的miRNAs表达谱,筛选差异表达的miRNAs(miR-30a),并进行实时荧光定量PCR验证。2.根据生物信息学数据库miRNA预测网站,预测miR-30a的靶基因,筛选其中与EMT和自噬相关的基因,进行双荧光素酶报告基因检测,明确miR-30a与预测靶基因的关系。3.运用免疫组织化学染色和Western blotting技术,检测上皮细胞标志物(E-cadherin)和EMT晚期标记物(vimentin和α-SMA)的表达;使用透射电镜技术观察自噬小体的形态。4.建立体外高糖模型,包括晶状体囊袋体外培养高糖模型和晶状体上皮细胞(HLECs-B3)高糖模型,从而模拟晶状体上皮细胞在体内的高糖状态。5.在体外高糖模型中,通过转染miR-30a模拟物和抑制物调节miR-30a的表达,进而达到调控EMT和自噬的目的。利用Western blotting和实时荧光定量PCR检测靶基因(SNAI1和BECN1)、EMT晚期标记物(vimentin和α-SMA)和自噬标记物(LC3BI和LC3BII)的蛋白和mRNA表达量;流式细胞仪检测晶状体上皮细胞的细胞凋亡率。研究结果第一部分miR-30a靶向结合SNAI1基因调控晶状体上皮-间质转化1.1糖尿病性白内障晶状体上皮细胞中EMT和miR-30a的表达变化(1)通过免疫组织化学染色和Western blotting发现,与正常晶状体相比,DC晶状体上皮细胞的E-cadherin蛋白表达下降,而vimentin和α-SMA的蛋白表达则增高。(2)miRNA芯片结果显示,与正常晶状体上皮细胞相比,DC晶状体上皮细胞中有73个miRNAs表达增高2倍以上,199个miRNAs表达下降超过两倍,其中miR-30a表达下降约180倍。实时荧光定量PCR结果也验证了 miR-30a在DC晶状体上皮细胞中表达明显下降。1.2体外高糖模型的晶状体上皮细胞中EMT和miR-30a的表达变化(1)免疫组织化学染色显示,高糖刺激可以晶状体上皮细胞中的vimentin和α-SMA表达增高。(2)实时荧光定量PCR结果显示,体外高糖环境下,晶状体上皮细胞的miR-30a表达明显下降。由此可见,我们建立的晶状体囊袋体外培养高糖模型可以充分模拟DC晶状体上皮细胞在体内的状态。1.3 SNAI1基因是miR-30a的靶基因(1)通过生物信息学数据库miRNA预测网站(TargetScanHuman,http://www.targetscan.org/),预测 miR-30a 可以靶向结合于 SNAI1 的 3’UTR(706-713)。(2)双荧光素酶报告基因检测显示,当pmiR-RB-REPORT-SNAIl-3’UTR和miR-30amimic(模拟物)共表达时,荧光素酶活性明显下降;将SNAI1 3’UTR的结合位点突变,解除了 miR-30a对SNAI1的负性调控作用,荧光素酶活性增强。因此,研究表明SNAI1是miR-30a的靶基因。(3)晶状体囊袋体外培养高糖模型中,miR-30a可以直接调控SNAI1的表达。实时荧光定量PCR结果显示,miR-30amimic组中SNAI1的mRNA表达明显下降(mimic NC 作为对照,P<0.05);miR-30a inhibitor(抑制物)组中 SNAI1的 mRNA 表达明显增多(inhibitor NC 作为对照,P<0.05)。Western blotting 结果显示,miR-30amimic组中SNAI1的蛋白表达明显下降(mimicNC作为对照,P<0.05);miR-30a inhibitor 组中 SNAI1 的蛋白表达明显增多(inhibitor NC 作为对照,P<0.05)。1.4 miR-30a通过SNAI1基因负性调控EMT(1)Western blotting结果显示,miR-30a mimic可抑制高糖诱导的EMT晚期标记物vimentin和α-SMA的蛋白表达(mimic NC作为对照,P<0.05)。(2)miR-30a mimic 可抑制 TGF-β 2 诱导的高 EMT 水平。Western blotting检测发现,加入TGF-β 2后vimentin和a-SMA的蛋白表达明显增高,说明高糖环境下TGF-β 2可诱导晶状体上皮细胞发生EMT;同时加入TGF-β 2和miR-30a mimic后,vimentin和α-SMA蛋白表达下降,EMT受到抑制。第二部分miR-30a靶向结合BECN1基因调控晶状体上皮细胞的自噬1.1糖尿病性白内障组织中miR-30a表达下降miRNA芯片结果显示,与正常晶状体上皮细胞相比,DC晶状体上皮细胞中miRNAs表达上调幅度最大的前5个miRNAs分别是miR-431-5p、miR-3169、miR-371a-3p、miR-1537和miR-593-3p,表达下调幅度最大的前5位分别是miR-30a-5p,miR-193a-3p,miR-204-5p,miR-184 和 miR-29b-3p。实时荧光定量PCR进行验证,结果与miRNA芯片一致,DC晶状体上皮细胞中miR-30a的表达明显下降。1.2糖尿病性白内障组织中自噬变化透射电镜结果显示,人DC晶状体上皮细胞中自噬小体体积增大,且单个自噬小体中包含多个待降解的线粒体。1.3 BECN1是miR-30a的靶基因(1)生物信息数据库(TargetScanHuman,http://www.targetscan.org/)预测,miR-30a可直接与BECN1的3’UTR(240-247)靶向结合。(2)双荧光素酶报告基因检测,当pmiR-RB-REPORT-BECN1 3’UTR和miR-30aagomir(模拟物)共表达时,荧光素酶活性明显下降;将BECN1 3’UTR的结合位点突变,可以解除miR-30a对BECN1的负性调控作用,荧光素酶活性增强。因此,研究表明BECN1是miR-30a的靶基因。(3)高糖培养环境下,miR-30a agomir可降低晶状体上皮细胞(HLECss-B3)中BECN1的蛋白表达量(agomirNC作为阴性对照,P<0.05);相反,miR-30a antagomir(抑制物)可导致BECN1蛋白表达增高(antagomirNC作为阴性对照,P<0.05)。1.4 miR-30a可抑制高糖诱导的晶状体上皮细胞的自噬(1)高糖通过BECN1依赖途径诱导晶状体上皮细胞的自噬。LC3B是最重要的自噬标记物,LC3BD/LC3BI比值增大代表自噬小体形成增多,比值下降则代表自噬小体形成受损。高糖培养环境下晶状体上皮细胞中的LC3BII/LC3BI比值明显增大;加入BECNlsiRNA后,LC3BII/LC3BI比值下降。(2)miR-30a可抑制高糖诱导的自噬。转染miR-30a agomir后,LC3BII/LC3BIL比值明显下降(agomir NC作为对照组,P<0.05);同时,LC3B的mRNA的表达也是下降(agomirNC作为对照组,P<0.05)。1.5 miR-30a可抑制晶状体上皮细胞的凋亡。高糖培养环境下晶状体上皮细胞的凋亡增多,加入miR-30a agomir后发生凋亡的细胞减少(agomir NC作为对照组,P<0.05)。结论1.正常晶状体和糖尿病性白内障晶状体上皮细胞中的miRNAs表达存在差异,其中miR-30a表达下降约180倍。2.晶状体囊袋体外培养高糖模型中,miR-30a通过靶向结合SNAI1基因,抑制晶状体上皮细胞EMT的发生。3.高糖培养环境下,miR-30a通过靶向结合BECN1基因,抑制晶状体上皮细胞的自噬。4.miR-30a可以抑制高糖诱导的晶状体上皮细胞的凋亡,对晶状体上皮细胞起保护作用。