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【目的】
鼻咽癌放疗后的存活细胞放射抗性增加,是引起鼻咽癌复发和转移的基础。Survivin是新近发现的放射抗拒相关基因。本实验探讨Survivin表达对鼻咽癌发生发展及放疗后复发的影响;观察鼻咽癌细胞的自发性凋亡及放射诱导凋亡、Survivin表达及其与放射敏感性的关系;探讨姜黄素及分次放疗联合姜黄素对放射抗拒细胞的Survivin表达及对其放射敏感性的影响,寻找以Survivin为靶点的放射增敏方法。
【方法】
采用免疫组化SP法检测31例放疗后复发鼻咽癌、30 例鼻咽非角化型鳞癌、30 例鼻咽粘膜慢性炎中 Survivin、Caspase-3的表达。对 CNE-2Z 放射后存活细胞Tr12给予单次剂量为6Gy的照射,获得再放射后存活细胞R18。对 CNE-2Z、Tr12及R18细胞采用MTT法绘制生长曲线;平板克隆形成实验绘制细胞放射存活曲线。流式细胞术、Hoechst33342/PI双荧光活染法检测CNE-2Z和R18的自发性凋亡及放射诱导凋亡的情况;RT-PCR 检测不同时间点和不同剂量射线处理后的CNE-2Z和R18的survivin mRNA 的表达;比色法检测Caspase-3活性。免疫细胞化学检测不同浓度姜黄素对Tr12细胞Survivin表达的影响,平板克隆形成实验检测低浓度姜黄素对Tr12细胞的放射增敏作用。对低浓度姜黄素与分次放疗处理过的R18细胞,用RT-PCR检测survivin mRNA的表达;比色法检测其Caspase-3 活性。
【结果】
(1)Survivin、Caspase-3 表达的阳性率,鼻咽粘膜慢性炎分别为23.33%(7/30)和96.67%(29/30),在鼻咽非角化型鳞癌中分别为73.33%(22/30)和16.67%(5/30),在放疗后复发鼻咽癌分别为83.87%(26/31),22.58%(7/31),两者在三组中的表达,差异有统计学意义(P<0.001),在鼻咽非角化型鳞癌组与放疗后复发组相比差异无统计学意义(P>0.05)。在放疗后复发鼻咽癌中,Survivin与Caspase-3的表达有显著负相关性(r=0.398,P<0.05)。
(2)在实验室获得可稳定传代的R18细胞,与母系CNE-2Z细胞相比,克隆形成能力下降,生长速度减慢。
(3)R18细胞与母系CNE-2Z相比,自发凋亡水平无明显差异,6Gy 射线作用后,在6h时间点可检测到亚二倍体峰,随时间延长凋亡率下降。同一剂量不同时间点及不同剂量同一时间点检测,R18细胞的凋亡水平均低于CNE-2Z。
(4)R18细胞的survivin mRNA 水平强于 CNE-2Z,放射线诱导survivinmRNA 表达水平的变化与放射剂量呈正相关,6Gy射线作用后,在6h时间点表达最低,随时间延长,表达逐渐升高。
(5)Caspase-3 活性在R18与CNE-2Z细胞之间无显著差异,R18细胞照射后Caspase-3活性短暂升高,6h、24h 与照射前相比差异有显著性。
(6)浓度在5μmol/L以上的姜黄素能使R18细胞的Survivin表达水平下降,并呈剂量依赖性。
(7)低浓度姜黄素与分次放疗结合能使R18细胞Survivin表达水平下降,Caspase-3蛋白活性增加。
【结论】
(1)Survivin参与了鼻咽癌的发生发展过程,在胞核的阳性表达可能与放射抗性相关。
(2)放射后存活细胞Tr12细胞继续经6Gy射线照射后获得可稳定传代的再放射后存活细胞R18,其放射抗性增加,可能与Survivin表达水平增高,Caspase-3蛋白活性下降,辐射诱导凋亡能力下降有关。
(3)低浓度姜黄素可提高Tr12细胞的放射敏感性。
(4)低浓度姜黄素与分次放疗结合可提高R18细胞的放射敏感性,可能与降低Survivin表达,提高 Caspase-3蛋白活性有关。