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目的:骨骼肌细胞内脂肪酸和甘油三酯的积聚是2型糖尿病(T2DM)状态下,导致骨骼肌对胰岛素的敏感性降低,引起胰岛素抵抗的重要原因。脂肪酸是骨骼肌的主要能量物质之一。脂肪酸在线粒体和过氧化物酶体中经β-氧化途径进行氧化。β-氧化途径包括氧化、加水、脱氢、硫解四步反应。线粒体β-氧化途径主要氧化短链、中链和大部分长链脂肪酸。肌型-肉碱脂酰转移酶Ⅰ(M-CPTⅠ)是其限速酶。极长链脂肪酸经过氧化物酶体β-氧化途径氧化。过氧化物酶体中存有两条β-氧化途径。一条途径主要与直链脂肪酸的氧化有关,由脂酰辅酶A氧化酶1(ACOX1)、L-双功能蛋白(LBP)、硫解酶组成;另一条途径主要与2-甲基支链脂肪酸的氧化有关,由ACOX3、D-双功能蛋白(DBP)、固醇携带蛋白X组成。过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)可通过调节其下游基因(如CPTⅠ、ACOX等)表达,影响骨骼肌脂肪酸β-氧化。脂肪酸在骨骼肌细胞中还可合成甘油三酯。二酰基甘油酰基转移酶1(DGAT1)是甘油三酯合成的限速酶。T2DM状态下,骨骼肌细胞内积聚大量的脂肪酸和甘油三酯,导致骨骼肌对胰岛素敏感性降低。但脂肪酸和甘油三酯积聚的分子机制还不清楚。这是否与骨骼肌中脂肪酸在线粒体及过氧化物酶体中的β-氧化降低以及脂肪酸在胞浆中的酯化增加有关呢?未见报道。基于上述原因,本研究以高脂饮食和小剂量链脲佐菌素(STZ)诱导的T2DM大鼠为实验对象,利用口服糖耐量实验、胰岛素敏感指数测定以及正葡萄糖钳夹实验等确定其产生胰岛素抵抗;组织油红O染色、组织游离脂肪酸和甘油三酯测定等实验确定游离脂肪酸、甘油三酯在骨骼肌中聚集后,用RT-PCR法观察骨骼肌线粒体和过氧化物酶体脂肪酸β-氧化途径中相关酶(M-CPTⅠ、ACOX1、ACOX3、LBP、DBP)基因、甘油三酯合成的限速酶DGAT1基因以及核受体PPARα基因mRNA的表达情况;用气相色谱分析骨骼肌组织游离脂肪酸的种类;用分光光度法测定脂肪酸β-氧化活性。从脂肪酸氧化分解以及脂肪酸合成甘油三酯的角度,探讨细胞内脂肪酸和甘油三酯积聚的原因,为T2DM的防治以及发病原因的研究提供实验依据。方法:1动物分组及取材成年雄性清洁级SD大鼠,随机分为正常对照组(Con)和2型糖尿病组(DM)。Con组给予普通标准饮食,DM组给予高脂饮食。自喂养高脂饮食八周后,通过高胰岛素正葡萄钳夹实验等证实DM组产生胰岛素抵抗;一周后,腹腔注射STZ 27mg/kg;72h后,检测空腹血糖,大于7.8mmol/L的大鼠确定为2型糖尿病大鼠。所有实验动物在继续喂养6周后处死,颈动脉取血,血清用于血糖、甘油三酯的测定;骨骼肌组织用于组织切片、RNA及脂质提取。2口服糖耐量试验大鼠空腹12h后,50%葡萄糖灌胃,检测0,30, 60,120 min血糖,分析两组大鼠血糖水平变化。3胰岛素敏感指数的测定大鼠空腹12h后采血,检测胰岛素水平和空腹血糖水平,计算胰岛素敏感指数。4正葡萄糖钳夹实验空腹状态下,静注胰岛素使血浆胰岛素维持较高水平,同时静脉补充葡萄糖使血糖维持基础水平。取稳态下葡萄糖输注速率来评价胰岛素敏感性。5葡萄糖氧化酶法测定血糖6氧化酶法测定血清甘油三酯7观察骨骼肌油红O染色8骨骼肌组织甘油三酯的测定骨骼肌组织用异丙醇匀浆,离心取上清,用于甘油三酯测定。9骨骼肌组织总游离脂肪酸测定骨骼肌组织用生理盐水匀浆,离心取上清,用于脂肪酸测定。10气相色谱仪测定骨骼肌脂肪酸百分含量11骨骼肌组织各相关基因mRNA相对表达量的测定用Trizol法提取RNA,用RT-PCR法测定M-CPTⅠ,ACOX1、ACOX3、LBP、DBP、PPARα及DGAT1 mRNA的相对表达量。结果:1口服糖耐量试验0,30, 60,120 min血糖值,DM组均高于Con组(P <0.01),表明,大鼠已产生糖耐量降低。2胰岛素敏感指数(ISI)DM组较Con组,ISI降低(-5.33±0.26 vs -4.60±0.14, P <0.01),表明糖尿病大鼠胰岛素敏感性降低。3正葡萄糖钳夹实验血糖稳定后,葡萄糖输注速率,DM组较Con组降低( 20.44±1.99mg/kg.min vs 27.97±1.72 mg/kg.min, P <0.01),表明糖尿病大鼠出现明显的胰岛素抵抗。4血糖DM组的血糖(15.55±2.69 mmol/L)均高于7.8mmol/L(本文所采用的T2DM血糖标准),且明显高于Con组(5.25±0.52mmol/L,P <0.01)。5血清甘油三酯DM组血清甘油三酯明显高于Con组(2.26±0.51 mmol/L vs 1.09±0.20 mmol/L,P <0.01)。6骨骼肌组织油红O染色DM组骨骼肌细胞中脂滴增多。7骨骼肌组织甘油三酯、游离脂肪酸DM组骨骼肌组织甘油三酯(38.1±7μmol/g组织vs 9.42±1.84μmol/g组织, P <0.01)、游离脂肪酸(15.57±2.92μmol/g pro vs 9.80±1.39μmol/g pro, P <0.01)明显高于Con组。8气相色谱仪测定骨骼肌脂肪酸含量DM组较Con组,十六烷酸、十八烷酸、十八烯酸、二十六烷酸,各成分百分含量差别无统计学意义。9骨骼肌各相关基因mRNA表达的变化9.1骨骼肌M-CPTⅠmRNA的相对表达量的变化脂肪酸在线粒体中β-氧化的限速酶M-CPTⅠmRNA相对表达量,DM组为1.303±0.260,Con组为1.437±0.283,两组的差别无统计学意义(P>0.05)。9.2骨骼肌LBP、ACOX1 mRNA的相对表达量的变化过氧化物酶体中β-氧化的第一条途径的部分酶的基因,DM组和Con组相比,ACOX1 mRNA(1.377±0.082 vs 1.498±0.187,P>0.05)表达差别无统计学意义,LBP mRNA(0.526±0.071 vs 0.812±0.121,P<0.01)表达降低。9.3骨骼肌DBP、ACOX3 mRNA的相对表达量的变化过氧化物酶体中β-氧化的第二条途径的部分酶的基因,DM组和Con组相比,ACOX3 mRNA(0.290±0.059 vs 0.508±0.096,P<0.01)表达降低,DBP mRNA(0.746±0.145 vs 0.764±0.116,P>0.05)表达差别无统计学意义9.4骨骼肌PPARαmRNA的相对表达量的变化DM组和Con组相比,PPARαmRNA(0.460±0.044 vs 1.089±0.213,P<0.01)表达降低,表明糖尿病大鼠骨骼肌细胞中PPARα表达下调。9.5骨骼肌DGAT1 mRNA的相对表达量的变化DM组和Con组相比,甘油三酯合成的关键酶,DGAT1 mRNA(0.690±0.124 vs 0.392±0.054,P<0.01)表达增加。结论:1. 2型糖尿病状态下,大鼠骨骼肌组织总游离脂肪酸含量增多可能与骨骼肌PPARα表达降低,过氧化物酶体脂肪酸β-氧化相关基因mRNA表达下降有关。2.2型糖尿病状态下,大鼠骨骼肌甘油三酯积聚可能与骨骼肌DGAT1 mRNA表达增强有关。