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干扰素(Interferon，IFN)是一种高活性、多功能诱生蛋白，具有抗病毒、抗肿瘤及免疫调节等生理功能，因而在医药、临床医学等领域有着重要的应用。与IFN-α／β相比，IFN-γ具有更强的免疫调节和细胞抑制活性，因而更加受到人们的重视。目前，人们不仅成功地构建了能够大量表达IFN-γ的基因工程菌，而且利用该基因工程菌生产的IFN-γ已被批准为临床用药。但是，在利用E.coli进行大量表达IFN-γ时，往往形成无活性的包涵体，这就要求对其进行复性，使其重新具有生物活性。 小分子伴侣sht GroEL 191-345是GroEL顶端区域氨基端残基191～345片段克隆表达产物。它是一种新型的协助蛋白质折叠体系。本文研究了在小分子伴侣的协助条件下，对由E.coli基因工程菌产生的重组人IFN-γ(rhIFN-γ)包涵体进行复性技术研究，探索较佳的复性条件，以期得到具有更高蛋白收率及活性的rhIFN-γ。 首先建立了rhIFN-γ的生物活性检测方法，测定细胞为人羊膜细胞Wish株，攻击病毒为水泡性口炎病毒(VSV)株。对以细胞病变(CPE)效应为基础的结晶紫染色法进行了条件优化，考察了结晶紫染液的用量及作用时间、溶媒提取时间、孔板效应及边缘效应等条件的影响。结果表明结晶紫染液的加入量在30～50μL之间较适宜，同时应当与染液作用时间相关联，用量大时作用时间相对减少；有机溶液脱色30min后测定较好，此时细胞核中的结晶紫已被提取完全，而结晶紫在脱色液中尚能稳定存在；为了最大程度利用微量板，同时考虑到边缘效应和孔板效应的存在，第1和第12列加细胞对照，第6和第7列加病毒对照。 其次在摇瓶的基础上进行了小分子伴侣sht GroEL 191-345的发酵罐培养。操作条件为：初始葡萄糖浓度为5g／L，接种量2.5％，转速为350r／min，通气量200L／h，装液量2.1L／3.7L，发酵温度33℃。经过超声波破碎、高速离心分离、亲和层析纯化及脱盐后得到sht GroEL 191-345 216.2mg／L发酵液。 然后考察了游离和固定化小分子伴侣sht GroEL 191-345对rhIFN-γ体外重折叠复性的作用。sht GroEL191-345的加入有效地促进了rhIFN-γ的复性，用含脲1.0mol／L，pH7.7的复性缓冲液将rhIFN-γ包涵体稀释至初始蛋白浓度100μg／mL，15℃复性4h后，加入sht GroEL 191-345的一组(sht GroEL 191-345同rhIFN-γ的摩尔比为2:1)蛋白收率提高了2.2倍，总活性提高了近3倍；将小分子伴侣固定化在NHS-activated Sepharose Fast Flow凝胶后，不但能重复利用，而且进一步提高了rhIFN-γ复性效率，在初始蛋白浓度为400μg／mL时，仍使蛋白质收率达到46.29％和比活达到9.05×10~6IU／mg。浙江大学硕士学位论文摘要 最后初步研究了人工分子伴侣(cTAB+p一CD)系统对thIFN一丫体外重折叠复性的作用。实验结果表明，人工分子伴侣系统也可以提高thIFN一丫的复性效果，较优复性操作条件:复性体系中cTAB浓度1 00林mol几，15℃下复性30min后，加入p一CD(p一CD与cTAB的摩尔比为18:l)，继续复性至4h终止，复性缓冲液pH7.7，脉浓度1.5 mol/L。在此操作条件下，当初始蛋白浓度为100林g/mL时，蛋白收率 29.76%，比活6.34、IO6IU/ing。