论文部分内容阅读
转化生长因子-β(Transforming growth factorβ,TGF-β)超家族是一组结构上保守但功能多样化的蛋白,对于许多重要的生理活动都具有调节作用。TGF-β超家族在卵巢功能的调节中发挥着重要作用,包括窦卵泡的募集、类固醇激素的生成、卵泡的发育、排卵及黄素化等。而TGF-β1是TGF-β亚家族中非常重要的一员。研究表明,TGF-β1在生殖活动的调节中具有重要作用,对卵泡的发育和类固醇激素生成的过程均有重要作用。多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)是育龄期妇女常见的一种复杂的内分泌代谢异常疾病,临床表现主要有:月经稀发或闭经、多毛、痤疮、肥胖等。其最重要的内分泌特征是高雄激素血症,雄激素的代谢障碍可导致雄激素升高。雄激素的生成可受到多种因子的调节作用,比如胰岛素生长因子、肾素等。P450芳香化酶(P450 aromatase cytochrome,P450arom)是由CYP19基因编码的,是雄激素向雌激素转化过程中的关键的限速酶,在多种组织中均有表达,P450arom对于生物学动态平衡至关重要,因此,他们对于催化、电子传递和药物靶向是必不可少的。P450arom是CYP酶类,作为雌激素生物合成过程中的关键酶,P450arom的作用至关重要。许多生理活动,如葡萄糖体内平衡、脂质体内平衡、脑功能、滤泡生长、骨矿化,以及排卵过程的协调都与其有着密切的关系。P450arom表达的异常常被认为是PCOS患者排卵障碍和雄激素水平过高的重要原因之一。P450arom的表达可受多种因素的作用影响,如促性腺激素、类固醇激素受体等,此外,其基因的突变、功能丧失及其单核苷酸多态性均可导致P450arom的表达发生变化。目前,P450arom在PCOS患者中的表达水平其具体的具体调控机制尚不清楚。有研究表明,在PCOS大鼠卵巢中,TGF-βI型受体(TGF-βreceptor I,TβR I)和TGF-βⅡ型受体(TGF-βreceptorⅡ,TβRⅡ)mRNA的表达较正常组明显升高,在人体内,PCOS患者血清中TGF-β1的含量高于正常人,而TGF-β受体的水平则受到抑制,提示我们TGF-β1可能与PCOS的发病机制有关。也有研究表明,PCOS患者血清中雌激素浓度比正常人低,且颗粒细胞中P450arom的表达下降、活性受到抑制,认为其是PCOS患者高雄激素血症和排卵障碍的重要原因。在成骨细胞、THP-1细胞等中TGF-β促进P450arom的基因转录;胎儿肝细胞、皮肤成纤维细胞、人滋养层细胞及牛颗粒细胞中TGF-β1抑制P450arom基因的转录。而在人颗粒细胞中,TGF-β1对P450arom的作用及其具体的调节机制目前仍不清楚。因此,本实验旨在研究在人颗粒细胞中,TGF-β1对P450arom表达的调控作用及其分子机制。目的探究人颗粒细胞中TGF-β1对P450arom表达的调控作用及其调控的分子机制。方法我们的研究模型为人原代颗粒细胞,探究TGF-β1在P450arom表达过程中的调节作用及其调控机制。首先探究TGF-β1对P450arom是否具有调控作用。1、采用不同浓度TGF-β1处理颗粒细胞后,观察P450arom在RNA和蛋白水平上表达情况的改变以及细胞培养液中雌激素的水平,探究TGF-β1的最佳作用浓度;2、分别观察TGF-β1处理颗粒细胞3h、6h、12h、24h后P450arom在RNA和蛋白水平表达情况的改变以及细胞培养液中雌激素的水平,探究TGF-β1的最佳作用时间。使用逆转录实时定量PCR(Reverse transcription quantitative real-time PCR,RT-qPCR)以及western blotting技术分别检测颗粒细胞中RNA和蛋白的表达水平,使用电化学发光免疫分析法(Electrochemiluminescence Immunoassay,ECLIA)检测细胞培养液中雌激素的水平。为了验证TGF-β受体是否参与TGF-β对P450arom的调控过程,给予TβRI的特异性抑制剂SB431542对颗粒细胞进行预处理,观察是否可抑制TGF-β1对P450arom的调控作用。为了验证Smad2/3下游信号通路是否参与TGF-β1对P450arom的调控过程,我们检测TGF-β1对颗粒细胞中Smad2/3磷酸化水平的调节作用。为了进一步验证Smads信号通路在TGF-β1对P450arom的调控中的关键作用,观察TGF-β1对P450arom的mRNA和蛋白水平的调节作用的改变。结果在人颗粒细胞中,TGF-β1能够促进P450arom的表达,进而促进雌激素的生成,且10ng/ml TGF-β1处理24h效果最佳。给予TβRI的抑制剂SB431542,发现其可抑制TGF-β1对P450arom的促进作用,提示了TβRI在TGF-β1对P450arom的调控作用中是必须的。TGF-β1处理颗粒细胞后可使磷酸化Smad2/3的水平显著提高,提示了TGF-β1对P450arom的调节作用是通过Smad2/3下游信号通路来介导的。结果显示TGF-β1对P450arom的促进作用受到抑制,提示了TGF-β1对P450arom的调节作用确实是通过经典的Smads信号通路介导完成的。结论1.在人原代颗粒细胞中,10ng/ml的TGF-β1作用24h后能明显促进P450arom mRNA和蛋白水平的表达,进而促进雌激素的生成;2.人颗粒细胞中,TGF-β1通过与TβRI结合的方式,进而促进P450arom mRNA和蛋白水平的表达;3.在人颗粒细胞中,TGF-β1通过激活Smads信号通路来促进P450arom mRNA和蛋白水平的表达。