急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)是临床常见病症,具有高患病率和死亡率。AKI发病机制复杂,炎症和免疫反应在AKI的病理生理进展中起重要作用。巨噬细胞(macrophages, Mφ)和树突状细胞(dendritic cells, DC)均为抗原提呈细胞(antigen presenting cells, APC),是炎症和免疫反应系统中的重要成员。有研究证明在·AKI肾脏中,MΦ浸润至肾髓质,它既可引起肾脏损伤,也能促进肾组织修复,但它所起的具体作用还不完全清楚。在临床上,缺乏早期诊断指标致使诊断及治疗延迟是AKI至今死亡率仍高的一个重要原因。目前最常用的检测指标是血肌酐(serum creatinine, SCr)、血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)及血清肌酐清除率(creatinine clearance rate, CCR),它们检测AKI的特异性和敏感性都不高。我们以前的研究发现肾脏损伤分子-1(kidney injury molecule-1, Kim-1)是一个高特异性的AKI检测指标。有报导认为中性白细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL),白介素-18(interleukin-18, IL-18)和脂肪酸结合蛋白(fatty acid binding protein, FABP)也可以作为AKI的检测指标。但所有这些标志物尚处于评估阶段,距临床应用仍有一段距离。所以,目前仍然缺乏一个或一组高特异性高敏感性的指标可早期诊断AKI,并指导后续治疗非转移性黑色素瘤糖蛋白(glycoprotein non-metastatic melanoma b, Gpnmb)是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白。它又称为造血生长因子诱导的神经激肽(hematopoietic growth factor inducible neurokinin, HGFIN)、树突状细胞相关的硫酸肝素糖蛋白整合素(dendritic cell-associated heparin sulfate proteoglycan-dependent integrin ligand DC-HIL)、骨激肽(osteoactivin, OA)。它的胞外段包括一个肝素结合域、一个整合素精氨酸甘氨酸门冬氨酸基序、以及一个多囊肾序列。Gpnmb在多种组织细胞中表达,如胚胎神经系统、胚胎肾单位、皮肤基底层、毛囊生发细胞、成骨细胞、破骨细胞、MΦ、视网膜色素上皮细胞和DC。近年来的研究表明,Gpnmb可能抑制MΦ的炎症反应和T淋巴细胞的活化,但它是否在急性肾损伤中起作用目前还不清楚。缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion, I/R)是引起AKI是常见原因之一。急性肾I/R动物模型是长期公认的AKI模型。我们以前的研究对小鼠和大鼠I/R模型肾脏进行表达性差异显示分析,发现Gpnmb基因在急性I/R模型肾脏中升高明显,而Gpnmb在受损肾脏中的具体表达位置并不清楚。有体外研究表明Gpnmb基因在MΦ和DC中表达,Gpnmb蛋白分为膜型和分泌型,但Gpnmb在尿液中的表达情况目前尚无报导。所以我们进一步检测Gpnmb在急性肾I/R动物模型肾脏和尿液中的表达水平,以期能更深入了解AKI损伤和修复的机制,也同时寻求更实用的AKI早期诊断指标；并在体外实验中,进一步探讨Gpnmb在APC及肾脏细胞中的表达特点。本论文分为两部分：第一部分为体内实验,建立小鼠和大鼠急性肾I/R模型,应用Northern blot、实时荧光定量PCR (quantitative ploymerase chain reaction, qPCR).原位杂交、免疫荧光染色及流式细胞仪等技术,观察对照组和I/R组动物肾脏中Gpnmb表达水平,并用免疫荧双染色对Gpnmb在肾脏的表达进行定位,同时用Western blot检测Gpnmb在对照组和I/R组动物尿液中的表达。第二部分为体外实验,原代培养小鼠和大鼠骨髓源性巨噬细胞(bone marrow derived macrophages, BMMcp)和小鼠骨髓源性树突状细胞(bone marrow derived dendritic cells, BMDC),并结合小鼠巨噬细胞株(RAW264.7细胞),观察Gpnmb在APC (Mφ和DC)的表达特点,并对其作用进行初步探讨。我们还原代培养了小鼠和大鼠近端肾小管上皮细胞(proximal tubular epithelial cells, PTC),并利用不同种属不同肾小管节段的细胞株(如LLC-PK1、NRK 52e、MDCK、MIMCD3)、人肾胚胎细胞株(293)及人肾癌细胞株(769-p),研究Gpnmb是否在肾小管上皮细胞、肾癌细胞及肾胚胎细胞表达。目的：建立小鼠和大鼠急性肾I/R模型,观察在对照组和I/R组动物肾脏中Gpnmb mRNA和蛋白表达水平(体内实验),并通过原代培养BMMφ, BMDC和PTC,及巨噬细胞株及各种肾小管上皮细胞株、肾癌细胞株及肾胚胎细胞株(体外实验),观察Gpnmb这些细胞中的表达特点,初步探讨Gpnmb的作用。方法：1、建立小鼠和大鼠急性肾I/R模型：I/R组小鼠和大鼠予以双侧肾蒂钳夹阻断血流30分钟,对照组(即假手术组)仅切开皮肤和肌肉,不作肾蒂血管钳夹。分别于术后第1、2、3、4、5、7、14天处死小鼠和大鼠。留取尿液和血液,收集处理肾组织标本。通过检测血.肌酐,观察，肾织织光镜形态学及Kim-1和vimentin的免疫荧光染色对I/R模型进行览鉴定。2、检测Gpnmb在对照组和I/R组肾脏及尿液中的表达：采用Northern blot, qPCR检测Gpnmb的mRNA表达水平；采用原位杂交定位Gpnmb mRNA在肾脏中的表达部位；采用免疫荧光染色观察Gpnmb蛋白在I/R组肾脏中表达的动态变化；采用免疫荧光双染色及流式细胞技术进一步确定Gpnmb在I/R组肾组织中APC (Mφ和DC)和T淋巴细胞上的表达,并通过Western blot检测Gpnmb在对照组和I/R组尿液中的表达。3、原代培养小鼠和大鼠BMMcp,通过免疫荧光染色和流式细胞仪检测MΦ表面标志物(小鼠：F4/80和CD11b；大鼠：CD68),来验证BMMcp培养成功与否。通过以上技术检测Gpnmb在BMMcp的表达。然后用不同细胞因子将BMMcp刺激分化成M1型和M2型BMMcp,通过检测M1型和M2型MqΦ的表面标志物及所表达细胞因子,来验证M1型和M2型BMMcp分化成功与否。再通过免疫荧光染色、流式细胞仪、Western blot及ELISA等技术检测Gpnmb在M1型和M2型BMMcp表达的特点。4、培养小鼠巨噬细胞株(RAW264.7),分成两组：一组用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)处理24小时(LPS组),另一组不用LPS处理(对照组),采用qPCR. Western blot及ELISA等技术,观察Gpnmb在LPS组及对照组RAW264.7细胞中的表达特点。5、原代培养小鼠BMDC,能过免疫荧光染色和流式细胞仪检测小鼠DC的表面标志物(CDllc),来验证BMDC培养成功与否。再通过同样方法检测Gpnmb在小鼠BMDC中的表达。6、原代培养小鼠和大鼠PTC，并培养各不同种属不同节段肾小管的细胞株(如LLC-PK1、NRK 52e、MDCK、MIMCD3)、人肾胚胎细胞株(293)及人肾癌细胞株(769-P),通过qPCR或免疫荧光染色检测Gpnmb在以上细胞的表达。用红色荧光标记的Gpnmb (Gpnmb-Fc-Cy3)处理原代培养的小鼠和大鼠PTC,检测PTC是否结合或吞噬外源性的Gpnmb。结果：1、小鼠和大鼠急性肾I/R模型建立成功：(1)SCr：与对照组相比,I/R组小鼠和大鼠SCr在术后第1天明显升高,于第2天起下降,至第7天基本恢复到正常水平。(2)光镜(HE染色)：对照组肾脏组织结构基本正常,I/R组肾组织可见肾小管肿胀、坏死、脱落,管腔扩张,肾间质炎性细胞浸润。(3)Kim-1(免疫荧光染色)：对照组肾脏组织中,Kim-1很少表达；在I/R组肾组织,Kim-1表达升高。(4) Vimentin(免疫荧光染色)：对照组肾脏组织中,Vimentin很少表达,I/R组肾组织,Vimentin表达升高。2、Gpnmb在小鼠和大鼠急性肾I/R模型中的表达升高;(1)Northern blot、qPCR和原位杂交结果示：对照组大鼠肾脏中Gpnmb mRNA表达低,而在I/R组大鼠肾脏中Gpnmb mRNA的表达显著增高。Gpnmb mRNA主要表达在肾髓质外部外缘(outer stripe of outer medulla, OSOM)的浸润细胞中。(2)免疫荧光染色和流式细胞仪结果示：对照组大鼠肾脏中,Gpnmb蛋白表达低,而在I/R组大鼠肾脏中明湿增多。Gpnmb主要表达在OSOM的浸润细胞中。I/R损伤第2天的肾脏中,Gpnmb+细胞位丁OSOM的肾间质中,至I/R损伤第4天,大部分Gpnmb+细胞进入了OSOM的肾小管管腔内。肾小球和肾小管上皮细胞未见Gpnmb表达。Gpnmb与MΦ标志物F4/80、CD68, MHC-ⅡCD86等共表达；(7)Western blot结果示：对照组小鼠尿液中Gpnmb表达水平很低,而I/R组小鼠的尿液,Gpnmb在术后第1天和第2天表达明显升高,第3天恢复到正常水平。3、Gpnmb在原代培养的小鼠和大鼠BMMφ中表达：(1)免疫荧光染色结果示：小鼠BMMφ中Gpnmb与F4/80共表达；大鼠BMMφ中,Gpnmb与CD68共表达。(2)流式细胞仪结果示：原代培养小鼠BMMφ中有94.7±6.1%细胞表达CD11b；在CD llb+BMMφ中Gpnmb阳性率为75.1士4.8%。(3)MO型BMMφ(未分化型)和M2型BMMφ的Gpnmb总表达量没有差别,但M1型BMMcp的Gpnmb表达总量增多。相对于M2型BMMφ, Ml型BMMφ细胞培养液中Gpnmb表达高,而细胞蛋白裂解液中的表达较少。根据Gpnmb在BMMφ的表达特点,BMMcp可分为三种类型：Gpnmb BMMφ;小单核Gpnmb+BMMφ;大多核Gpnmb+BMMφ。4、Gpnmb在RAW264.7巨噬细胞株表达：(1)qPCR和Western blot结果示,相对于对照组,Gpnmb mRNA表达和蛋白表达在LPS组增高(p<0.05)。(2)免疫荧光染色结果示,有三种类型的RAW264.7细胞：Gpnmb- RAW264.7细胞；小单核Gpnmb+RAW264.7细胞；大多核Gpnmb+RAW264.7细胞。在对照组中,Gpnmb多表达在细胞核周围：在LPS组中,小单核Gpnmb+RAW264.7细胞的Gpnmb先进入细胞内小泡,经细胞膜释放到细胞外；而在大多核Gpnmb+RAW264.7细胞中Gpnmb的表达仍在细胞核周围。5、Gpnmb在原代培养的小鼠BMDC表达：(1)免疫荧光染色显示,我们培养的细胞中大部分表达CD11c, Gpnmb与CD11c有共表达。(2)流式细胞仪结果示,在我们培养的细胞中,有70.28±8.25%细胞为CD11c阳性; 33.51±2.32%CD11c+细胞为Gpnmb阳性6、Gpnmb在原代培养的小鼠和大鼠PTC、各肾细胞株表达很低：(1)相对于RAW264.7细胞,Gpnmb mRNA在原代培养PTC及各肾小管细胞株(如LLC-PK1 NRK 52e、MDCK. MIMCD3)、人肾胚胎细胞株(293)及人肾癌细胞株(769-P)的表达水平低。(2)免疫荧光染色显示：Gpnmb蛋白在原代培养PTC中表达低。(3)原代培养PTC不能结合或吞噬荧光标记的Gpnmb (Gpnmb-Fc-Cy3)。(4)原代培养的小鼠BMMφ能将结合和吞噬Gpnmb-Fc-Cy3进入溶酶体。结论：1、Gpnmb在I/R肾脏和体外培养的APC细胞中表达,Gpnmb可能参与炎症免疫反应,在AKI的病理生理进程中起作用。2、在对照组小鼠尿液中,Gpnmb表达低；而在I/R组小鼠尿液中,Gpnmb表达升高,Gpnmb可能作为早期诊断AKI的标志物。