研究背景胃癌是一种常见的恶性肿瘤,在美国,其发病率及死亡率位列第14位,每年新增胃癌确诊病例数约为21000人,死亡数约为10000人。胃癌患者中,男性所占比例较大,约占60%左右。胃癌是一种老年性疾病,70岁左右的人群发病率最高。在美国社会的各个种族中,非洲裔、亚洲裔以及西班牙裔美国人的胃癌发病率要高于白种人的胃癌发病率。在世界范围内,胃癌是第四大恶性肿瘤,其死亡率位居第二位。胃癌在东亚和南美洲发病率较高,但是近些年来,其发病率在发达国家呈逐年上升趋势,约占世界范围内胃癌新增病例数和死亡数的三分之二。而在美国,胃癌的发病率却在逐渐下降。在发达国家阵营中,日本和韩国的胃癌发病率则最高。胃癌在日本是最常见的恶性肿瘤。正因为如此,日本政府于上世纪七十年代启动了胃癌筛选计划,得益于该计划的实施,胃癌在日本的发病率下降了50%。尽管胃癌在日本的发病率在下降,但是其大部分都是末端胃癌。胃癌发病的危险因素主要是环境因素和基因遗传因素。1994年,国际癌症研究机构明确提出幽门螺杆菌是一种致癌物。大量的科学研究也证实胃癌发病与幽门螺杆菌感染有关。目前认为,幽门螺杆菌感染导致胃癌形成的主要机制是感染导致胃粘膜产生慢性炎症,长期的感染导致胃炎,主要集中在胃体,并伴有胃粘膜的萎缩。在一些患者中,这一病变还可导致胃肠道粘膜发生化生、异型增生,直至最后发生肠型腺癌。研究表明,在胃肠道粘膜发生化生的过程中,大量的基因存在异常表达,最终可能导致胃肠道粘膜发生癌变,例如,环氧酶2、细胞周期素蛋白D2、p53在胃粘膜化生过程中过表达,微卫星不稳定性,p27的表达降低以及CDX1、CDX2等转录因子在胃粘膜化生过程中的异常表达。这些均表明胃肠道粘膜化生是胃癌发病过程中的一个重要的危险因素。但是并不是每一个发生肠化生的患者都会发展成胃癌。研究表明,宿主炎症反应在这一过程中发挥重要作用。有文献报道,白介素1表达升高的患者发生胃癌的风险较大。此外,高盐食物,特别是一些含有大量的硝酸盐的腌制或者熏制的食物,再加上水果、蔬菜的摄入量较低,经常有这一饮食习惯的人群的发生胃癌的几率将会大大增加。这一作用机制,目前主要是认为食物中含有的硝酸盐成分在细菌的作用下转换成亚硝基化合物,而水果及蔬菜中则富含抗坏血酸,抗坏血酸能有效清除亚硝酸基化合物及氧自由基。目前,胃癌的主要治疗方式是手术切除,然后辅以放化疗,尽管这一治疗方式仍然行之有效,但是对胃癌转移患者却疗效不佳。因此,寻找胃癌新型早期诊断和预后评估因子仍然是一项迫在眉睫的任务。细胞外信号分子,如致癌基因或抑癌基因,是许多学者的研究热点。作为分子标记物,p53,钙黏蛋白E (E-cadherin)和HER-2往往提示胃癌患者预后差。值得我们注意的是,各种各样的蛋白酶类,包括基质金属蛋白酶类(MMPS)和丝氨酸蛋白酶类,因其是细胞外基质物质的降解产物,往往也在胃癌发生-发展过程中发挥重要作用。丝氨酸蛋白酶抑制剂2(SERPINE2),别称前列腺微管连接蛋白1(PN-1),是丝氨酸蛋白家族中的一员,主要负责调节凝血酶、尿激酶、血纤维蛋白溶媒和胰蛋白酶的活性。在慢性阻塞性肺疾病和小叶性肺气肿中丝氨酸蛋白酶抑制剂2作为一个敏感因子首次被发现。最近的研究表明,丝氨酸蛋白酶抑制剂2与肿瘤形成密切相关。有文献报道,丝氨酸蛋白酶抑制剂2在乳腺癌、结肠癌、口腔鳞状细胞癌等多种恶性肿瘤中呈现异常表达。此外,丝氨酸蛋白酶抑制剂2在前列腺癌中同时也是一种抑癌基因,有降低肿瘤细胞增殖和血管形成的作用。而恰恰相反,另有文献报道,丝氨酸蛋白酶抑制剂2在睾丸癌的移植物模型中有促进淋巴结转移的作用,提示其可能同时也是一个致癌基因。但是,丝氨酸蛋白酶抑制剂2在胃癌中的表达、其与胃癌患者预后的关系以及其在胃癌细胞中的生物学功能仍然鲜有报道。本实验通过应用实时定量免疫荧光聚合酶链式反应(real-time quantitativePCR.)测定SERPINE2mRNA在243例胃癌样本中的表达,研究其表达与胃癌各临床病理参数以及患者预后的关系。此外,我们还通过应用细胞转染、细胞增殖实验、软琼脂克隆集成实验、细胞迁移和浸润实验进一步研究SERPINE2胃癌细胞株SGC7901中的生物学功能。方法：1.应用实时荧光定量-聚合酶链反应(Real-time PCR)方法检测SERPPINE2mRNA在胃癌组织及对应正常胃黏膜组织中的表达情况；2.为验证其生物学功能,对胃癌细胞SGC7901进行siRNA转染,其转染效率用蛋白质免疫印迹方法(western blot)进行验证。应用细胞增殖实验、软琼脂克隆集成实验、细胞迁移和浸润实验,分别测定SERPINE2对胃癌细胞SGC7901增殖、迁移和浸润能力的影响。3.应用χ2检验或Fisher精确概率法检验SERPINE2mRNA表达与胃癌各临床各病理参数之间的关系；应用Kaplan-Meier法、log-rank分析进行假设检验生存分析,COX比例风险模型用于风险因素的单变量、多变量统计分析方法分析SERPINE2mRNA的表达对胃癌手术患者预后的影响。结果：1.Real-time PCR:SERPINE2mRNA在癌旁组织,癌组织以及合并有淋巴结转移的胃癌组织中表达逐步上调。SERPINE2mRNA在胃癌组织、胃癌细胞SGC7901中表达较其在正常组织中的表达分别上调5.09倍、4.18倍,差异具有统计学意义(P=0.0089,0.0015)。与正常组织相比,SERPINE2mRNA在合并有淋巴结转移的胃癌组织中表达上调6.79倍,差异具有统计学意义(P=0.004)。而SERPINE2mRNA在无淋巴结转移的胃癌组织中的表达较其在正常组织中的表达上调2.24倍,差异无统计学意义(P=0.0682)。此外,值得我们注意的是,SERPINE2mRNA在合并有淋巴结转移的胃癌组织中的表达较其在无淋巴结转移的胃癌组织中的表达上调3.02倍,差异具有统计学意义(P=0.023)。2.SERPINE2mRNA表达水平与胃癌临床参数之间的关系：我们规定SERPINE2mRNA表达上调超过1.25倍认为其在该样本中呈现高表达,反之则为低表达。数据显示,有157例样本呈现高表达(157/243,64.4%),86例样本呈现低表达(86/243,35.6%)。应用Fisher’s精确检验方法分析SERPINE2mRNA表达水平与胃癌各临床病理参数之间的关系,结果显示SERPINE2mRNA高表达与胃癌淋巴结转移(P=0.01)、远处转移(P=0.018)以及UICC分期(P=0.001)显著相关,而与年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置、分化程度Lauren分型无显著相关(表1)。3.SERPINE2mRNA表达水平与胃癌患者预后之间的关系：应用Kaplan-Meier方法绘制胃癌患者的生存曲线,结果显示SERPINE2mRNA表达水平升高的胃癌患者的总体生存时间和无瘤生存时间均显著低于SERPINE2mRNA表达降低的胃癌患者的总体生存时间和无瘤生存时间,差异具有统计学意义(P<0.001,图2)。单变量回归分析显示T分期、淋巴结转移、远处转移、UICC分期、低分化以及SERPINE2mRNA高表达均对患者的总体生存时间和无瘤生存时间有影响。以上各影响因素均同时进入多因素回归分析,结果显示SERPINE2mRNA高表达是一个独立的胃癌预后因素(P=0.000, HR=3.05,95%CI=1.78-4.96; P=0.002, HR=2.30,95%CI=1.57-3.55)。4. SERPINE2对胃癌细胞SGC7901增殖的影响：应用MTS方法检测SERPINE2对胃癌细胞SGC7901增殖的影响,研究SERPINE2在胃癌细胞中的生物学功能。实验分成两组：SERPINE2转染组为实验组、对照组。转染成功后并蛋白质印记法(western blot)检验转染效率。与对照组相比,SERPINE2在实验组中的表达水平显著下降,差异具有统计学意义((P=0.0039)。通过观察分析24小时、48小时、72小时时间段的胃癌细胞增殖能力,数据显示两组细胞增殖能力无显著差别(P>0.05)。5.SERPINE2对胃癌细胞SGC7901迁移和浸润的影响：应用侵袭小室实验检测SERPINE2转染后对胃癌细胞SGC7901迁移与侵袭能力的影响。在肿瘤迁移与侵袭实验中,我们发现SERPINE2转染组的肿瘤细胞计数均显著低于对照组中的肿瘤细胞计数,差异具有统计学意义(P=0.0158,0.008)。此外,我们还应用软琼脂集落形成实验测定SERPINE2转染后是否对肿瘤细胞的集落形成能力有影响,实验结果显示SERPINE2转染后的胃癌细胞SGC7901的集落形成能力显著低于对照组的集落形成能力,差异具有统计学意义(P=0.001)。结论：SERPINE2在胃癌组织中呈现过表达,且与胃癌多个临床病理参数及胃癌手术患者的预后显著相关,提示SERPINE2可能在胃癌发生-发展过程中发挥重要作用,可能是一个新型的胃癌分子标记物。SERPINE2具有促进胃癌细胞SGC7901迁移与浸润以及锚定非依赖生长的作用,提示SERPINE2还可能是一个新型的胃癌治疗靶点,为新型化疗药物的研制提供帮助。意义：1.研究了SERPINE2在胃癌组织中的表达,及其与胃癌多个临床病理参数及胃癌手术患者的预后的相关性；2.研究了SERPINE2在胃癌细胞SGC7901迁移与浸润中的表达,及其相关性；3.为SERPINE2作为是一个新型的胃癌治疗靶点,为新型化疗药物的研制提供帮助。