【摘 要】
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紫花前胡（Angelica decursiva）为伞形科当归属的多年生草本植物,其根具有抗炎止咳的功效。紫花前胡根的主要药用成分为香豆素类化合物和香豆素糖苷类化合物,因此负责催化香豆素糖基化反应的各类糖基转移酶一直备受关注。目前对负责形成O-糖苷的O-糖基转移酶的研究较为深入,而对于合成C-糖苷香豆素的C-糖基转移酶却鲜有报道。课题组依据生物信息学分析结果,从紫花前胡转录组数据中筛选到一条C-糖基
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紫花前胡（Angelica decursiva）为伞形科当归属的多年生草本植物,其根具有抗炎止咳的功效。紫花前胡根的主要药用成分为香豆素类化合物和香豆素糖苷类化合物,因此负责催化香豆素糖基化反应的各类糖基转移酶一直备受关注。目前对负责形成O-糖苷的O-糖基转移酶的研究较为深入,而对于合成C-糖苷香豆素的C-糖基转移酶却鲜有报道。课题组依据生物信息学分析结果,从紫花前胡转录组数据中筛选到一条C-糖基转移酶基因,遂将其命名为AdCGT,针对这个新发现的C-糖基转移酶AdCGT的酶学性质、蛋白结构、催化功能及催化机制展开了一系列的研究。该研究对紫花前胡中C-糖基转移酶催化香豆素碳糖苷的形成途径有了进一步的认识,为解析C-糖基化催化机制奠定了分子基础,并为以后香豆素碳糖苷的生物合成提供了技术参考,为进一步通过酶法合成糖苷或通过合成生物学的方法修饰化合物提供了理论支持。本研究的主要结果如下:（1）通过克隆、测序获得AdCGT基因蛋白编码区全长,利用在线工具对其进行生物信息学分析,发现AdCGT蛋白的分子量为50.415kD、等电点为6.37,是无跨膜区的亲水性蛋白。根据预测的蛋白空间结构判断其属于GT-B类型,被归类为糖基转移酶GT1家族,通过序列比对和进化树分析发现AdCGT与SbCGT同源性最高。（2）通过构建异源表达载体Psj8-MBP-AdCGT,利用大肠杆菌原核表达系统获得AdCGT粗蛋白;进一步利用亲和层析技术进行了AdCGT蛋白的纯化。（3）以5,7-二羟基香豆素为底物,UDPG为糖基供体,通过超高压液相色谱法对AdCGT粗蛋白进行体外催化活性验证。发现AdCGT具有酶活性,可以催化5,7-二羟基香豆素生成2种不同产物,并且2种催化产物均能在强酸条件下稳定存在。经鉴定,可确定其中一个是C’6位置的C-糖苷,推测另一个为C’8位置的C-糖苷。（4）对16种香豆素类、类黄酮类化合物进行AdCGT底物特异性筛选,发现AdCGT对5,7-二羟基香豆素、根皮素、2,4,6-三羟基苯乙酮具有较高活性。AdCGT表现出C-糖基化活性的同时也表现出了微弱的O-糖基化活性。（5）以5,7-二羟基香豆素为底物,进一步对AdCGT的最佳反应条件进行了筛选,发现反应体系温度为40℃、pH=9、不加二价金属阳离子时,AdCGT表现出的催化活性最高。（6）以已被解析的SbCGTb蛋白结构为模板进行同源建模,然后经过分子对接和定点突变试验来确定识别受体和供体小分子的关键氨基酸。实验结果发现将AdCGT第24位的组氨酸（His24）突变成丙氨酸（Ala24）时,AdCGT完全失活,说明His24是AdCGT行使催化活性的关键氨基酸,可能在AdCGT识别受体和供体小分子过程中起重要作用。
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